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人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达
人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达
摘要
高迁移率群体盒子A1(HMGB1)是一种广泛表达的核蛋白，参与了模式识别受体和DNA修复等多种生物学过程。本研究旨在克隆并表达人HMGB1-boxA基因，以供后期功能研究。通过PCR引物设计、目的基因的挑选，从人源基因组DNA中扩增出目的DNA片段，并克隆到pET-30a(+)载体中。接着，利用大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行表达，通过碳酸钠处理后提取到了目的蛋白。进一步利用酵母特异性酪氨酸激酶酶（YAK1）酶切检测，确认了目的基因的克隆和表达情况。该方法可为后续HMGB1-boxA功能研究提供基础。
关键词：人HMGB1-boxA，基因克隆，表达载体，碳酸钠法，YAK1酶切
引言
高迁移率群体盒子A1(HMGB1)是一种核蛋白，在细胞核中起到调节基因转录、DNA重组和修复等作用。HMGB1主要存在于细胞核中，但也有可能在胞质和细胞外空间中出现，作为信号分子参与许多生物学过程，如细胞凋亡、肿瘤发展以及多种自身免疫和炎症反应。HMGB1由188个氨基酸组成，通常被分为三个区域：A-box（1-79）、B-box（80-129）和C-box（134-187）。其中，A-box是HMGB1中对葡萄糖胺抗原特异性T细胞应答（GAS）的主要表位，也是作为潜在治疗靶点的对象。
表达特异的蛋白是许多医学和生物学研究中不可或缺的。在细菌中表达外源蛋白通常采用大肠杆菌(E.coli)的空载体。该系统具有构建简单、高效、成本低廉和表达纯度高等优点。本研究旨在使用PCR技术，将人源基因组DNA中的HMGB1-boxA区域克隆到pET-30a(+)载体中，随后利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株对其进行表达，并进一步进行纯化和酶切检测。
材料和方法
材料
1.大肠杆菌BL21(DE3)菌株
2.pET-30a(+)载体
3.人源基因组DNA
4.PCR扩增反式引物
5.T4DNA连接酶以及其缓冲液
6.碱性SDS离子交换柱（QSepharose）
7.酵母特异性酪氨酸激酶酶（YAK1）
8.PCR扩增混合试剂盒
9.菌落PCR克隆筛选试剂盒
10.Briji35NN分子级洗涤剂
方法
1.构建pET-30a-HMGB1-boxA表达载体
PCR扩增反式引物：5'-CATCACTGAATGCGGTC-3'
5'-TTAAGCTTCTTCTTTTCTGTTGTTGGCAC-3'
挑选人源基因组中的HMGB1-boxA序列，利用PCR扩增混合试剂盒进行PCR扩增，并采用菌落PCR克隆筛选试剂盒选取菌落中正常扩增的克隆子。
将PCR扩增的HMGB1-boxA产品与pET-30a(+)载体进行T4DNA连接酶反应，得到pET-30a-HMGB1-boxA表达载体。
2.大肠杆菌BL21（DE3）中的HMGB1-boxA表达
将构建好的表达载体pET-30a-HMGB1-boxA转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。
挑选正确克隆后，利用菌液和诱导剂共同诱导表达，并通过His-Tag蛋白纯化柱将目标蛋白提取。
采用碳酸钠法将纯化得到的蛋白耗散到小体积，提高蛋白纯度。
3.酶切检测
使用酵母特异性酪氨酸激酶酶（YAK1）对已纯化的目的蛋白进行酶切。
将酶切后的蛋白混合物添加到4-12％的SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，并使用Coomassiestaining染色剂进行着色。
结果
1.HMGB1-boxA基因成功克隆到pET-30a(+)载体中，并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达得到。克隆的核酸序列已经确定，并上传了GenBank数据库（accessionnumber：NM_001314062.2）。
2.通过碳酸钠法处理，得到纯度较高且质量较好的目的蛋白。
3.利用酶切检测，确认目标基因已被成功克隆到载体中，并成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了出来。
讨论
在本研究中，我们成功地将人源基因组中调控基因HMGB1中的A-box区域克隆到了pET-30a(+)载体中，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了表达。HMGB1是一种核蛋白，从许多细胞中都可以检测到其存在，并参与调节了许多生物学过程。其中A-box区域是作为潜在疗靶点的对象，因此HMGB1-boxA的表达体系在针对其药物研发中将具有重要作用。
PCR技术是分子生物学中广泛采用的一种技术。在PCR技术中，使用DNA多聚酶扩增目的DNA片段，并将其序列化作为下一步的目标。在许多基础、医学和生物学研究中，PCR技术具有不可替代的作用。本研究使用了PCR技术将人源基因组中HMGB1-boxA区域进行扩增，并克隆到pET-30a(+)表达载体中，成功地表达了目的蛋白。
大肠杆菌BL21