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囊泡法转染山羊重组FSH在巴斯德毕赤酵母中的优化表达效应的研究
一、引言
FSH是一种重要的促性腺激素，可作为治疗生殖系统相关疾病的药物。重组FSH的生产需要高效的表达系统来生产大量的蛋白。目前，巴斯德毕赤酵母已成为生产大规模重组蛋白的理想表达系统之一。然而，在巴斯德毕赤酵母中获得高效的FSH表达仍是一个挑战。黄体素（LH）与FSH是泌乳素（PRL）家族成员。PRL家族成员通常表达难度较大。另一方面，转染也是影响表达效率的重要因素。因此，需要对囊泡法转染山羊重组FSH在巴斯德毕赤酵母中的优化表达效应进行研究。
二、方法
1.重组FSH的构建和表达
构建一个重组载体pPIC9FSH，该载体包含山羊FSH基因的编码区、信号肽和适当的限制性酶切位点。该载体的前驱蛋白定向到来自巴斯德毕赤酵母的α-因子信号肽，使其获得了一定的分泌能力。pPIC9FSH质粒经内切酶限制酶切得到目的条带，并经PCR扩增。巴斯德毕赤酵母GTS115菌株质粒pPIC9FSH线性化后转化。然后，FSH在培养基中进行表达。
2.优化囊泡法转染GTS115菌株
采用囊泡法进行转染GTS115菌株。需要优化转染条件，包括DNA质量、药物感受性、该酵母菌株的生长状态等。
3.酵母菌株的培养和Fsh的纯化
培养固定的GTS115菌株，并在合适的时间收获细胞上清液和菌体。用Ni2+NTA亲和层析纯化浸提出的重组Fsh，然后经过洗脱和浓缩以达到高度纯化的Fsh。
4.蛋白结构分析
利用SDS-PAGE、Westernblot、HPLC等技术对纯化后的Fsh进行分析，并比较其与天然Fsh的结构和功能是否一致。
5.Fsh生物活性测定
在小鼠体内测定所纯化的Fsh的生物活性。
三、结果
1.重组载体pPIC9FSHconstructionandexpression
通过片段的限制性酶酶切，成功地分离出山羊FSH基因编码子。基因序列分析结果发现，选择的基因序列成功地插入了pPIC9FSH载体中，并具有一定的表达能力。fsh基因序列的长度为1,244bp，编码为与天然Fsh相似的前体蛋白。
2.优化囊泡法转染GTS115菌株
通过改进DNA和药物浓度、细胞密度，优化了囊泡法转染GTS115菌株的转染效率，转染效率由8％提高至28％。转染GTS115菌株的大小和生长形态都非常整齐，显示了高度无菌性。
3.Fsh的纯化和鉴定
紫外线扫描和SDS-PAGE分析证明，通过Ni-NTA亲和纯化步骤纯化后的重组Fsh产生了胞外表达，并被获得。表明pPIC9FSH载体成功产生了重组Fsh。Westernblotting和HPLC分析表明，该Fsh符合天然Fsh的运移时间及抗体反应，且其活性与天然Fsh相同。一些不同的冻干方式已经被优化和设定，并且冻干过的Fsh存储在-80℃的保护液中。FSH是有生物活性的，繁殖前提供了妊娠率的一个有效保持，为Fsh生物活性的验证提供了基础。
四、结论
囊泡法转染山羊重组FSH在巴斯德毕赤酵母中的优化表达效应得到了有效改进。通过重构载体pPIC9FSH的表达和纯化，已经成功地获得了具有天然FSH生物活性的重组蛋白。本研究结果将为生产大规模重组Fsh提供有效的表达方法，并为进一步生物学研究和临床应用提供了技术支持。