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实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践主要内容PCR:基本原理PCR:基本原理Real-timeqPCR扩增曲线(primarycurve)Ct值(CycleThreshold)Ct值(CycleThreshold)Ct值可以确定初始模板量?y=-ax+b测定荧光定量PCR反应的有效性 --线性的标准曲线:相关系数R2 --扩增效率: 扩增效率(E)=10-1/斜率-1荧光定量PCR检测方法SYBRGreenI融解曲线分析Taqman工作原理Taqman工作原理SYBRGreenI与Taqman对比荧光定量PCR解析方法相对定量2-ΔΔCt法2-ΔΔCt法相对定量分析相对定量举例SYBRGreen法实验流程样本处理与RNA提取逆转录RT-PCR一步法还是两步法?荧光定量PCR体系总原则与普通PCR相同: 避免引物二聚体,避免二级结构 扩增片段长度(80-300bp) 推荐做跨intron设计MastermixMastermix的优化MasterMix 误差控制 使用Mastermix 配置预混体系 设置生物学重复(不同个体) 技术性重复(复孔) 阳性和阴性对照 数据分析操作注意事项案例分析总体原则案例分析–扩增曲线扩增曲线 --低浓度样本没有稀释好 --重复性差,加样存在误差案例分析案例分析–扩增曲线案例分析–扩增曲线案例分析–熔解曲线案例分析–熔解曲线各点之间线性关系 各孔的重复性案例分析–标准曲线扩增效率低 (引物的扩增效率、引物与模板的最适比例) --调节引物终浓度Troubleshooting