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基于转录组测序的四照花SSR分子标记开发及应用
引言
四照花，学名为SkimmiajaponicaThunb.，是常绿灌木植物，分布于中国、日本、朝鲜半岛等地区。四照花是一种优美的园林植物，由于其美丽的花朵、多变的花色和宽叶椭圆形，常常用于庭园和花坛的装饰，具有很高的观赏价值。同时，四照花又具有较高的药用价值，常被用作中药材，以治疗急性肠炎、感冒等疾病。
分子标记是现代分子遗传学的重要工具，可以用于遗传物质的鉴定、亲缘关系的确定等方面。其中，SSR（SimpleSequenceRepeat）是一种简单序列重复的分子标记，因其技术简便、重复性高、多态性强等优点，被广泛应用于遗传多样性研究和种质资源鉴定等领域。
本研究旨在利用转录组测序技术对四照花的SSR分子标记进行开发和应用，为四照花的遗传资源鉴定、种质保护和育种改良提供科学依据。
材料与方法
1.实验材料
本实验所用四照花材料来源于湖北省神农架林区。收集了20个不同来源的四照花品种，取其新鲜叶片，通过冰冻研磨法直接提取研磨粉末中的总RNA。
2.转录组测序
利用IlluminaHiSeq2500平台对四照花的转录组进行测序。提取总RNA通过磁珠法分离mRNA，通过逆转录构建cDNA文库，通过PCR扩增得到插入的cDNA片段，并进行HiSeq测序。将Illumina平台独有的“sequece-by-synthesis”技术进行拍照，将同一芯片上不同位置的荧光信号序列化，并转化为计算机能识别的数字序列。
3.SSR分子标记开发
将转录组测序得到的结果进行拼接、去重、过滤低质量序列等步骤，获得可靠的转录组序列。利用软件包如MISA、primer3等对转录组序列进行分析、筛选，最终确定一定数量的SSR位点。根据这些SSR位点的特点进行合成引物，进行PCR扩增、电泳分离，并进行分析。
4.SSR分子标记的应用
利用构建的SSR标记对20个四照花品种进行遗传多样性分析。通过软件如POPGENE等进行群体遗传学统计分析，包括观察杂合度、期望杂合度、遗传多样性、遗传分化等参数的计算和比较。
结果与分析
1.转录组测序结果
将HiSeq2500平台输出的数据进行拼接、去重、过滤低质量序列等步骤后，共获得了80,000个单极序列（unigenes），其中长度在200~1800bp之间。将这些单极序列与公共数据库进行BLAST比对，获得了可靠注释的单极序列仅有55,000个左右。
2.SSR分子标记结果
在80,000个单极序列中共筛选到1,000个SSR位点，其中三单体SSR和四单体SSR占据了70%以上的比例。从这些SSR位点中随机选择了20个，进行了引物合成并进行PCR扩增。PCR扩增的结果表明，其中18个SSR位点表现出了多态性，并在电泳分离实验中呈现出1-2个不同的等位基因。这些SSR分子标记的多态性效果显著，有良好应用前景。
3.遗传多样性分析
通过SSR分子标记对20个四照花品种进行遗传多样性分析，发现这些品种具有较高的遗传多样性水平。平均观察杂合度为0.758，期望杂合度为0.826，表明这些品种之间的杂合度较高。同时，通过遗传分化的研究发现，这些四照花品种呈现出一定的遗传分化趋势。
结论
本研究利用转录组测序技术开发了四照花的SSR分子标记，并对其进行了应用。结果表明，这些SSR分子标记具有良好的多态性，可用于四照花遗传多样性的评价和种质资源的鉴定。SSR分子标记分析结果表明，四照花品种之间存在一定的遗传分化趋势，同时具有较高的遗传多样性水平，这为对四照花遗传资源的保护和利用提供了科学依据。