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鹅干扰素-α在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究
摘要
随着人们对传染病的治疗和预防的需求不断增加，越来越多的生物制剂被开发出来用于临床应用。本实验对鹅干扰素-α在毕赤酵母中的分泌表达和抗病毒活性进行了研究。结果表明，经过进一步优化后，毕赤酵母表达的鹅干扰素-α可以在培养基中达到很高的分泌水平，同时表现出显著的抗病毒活性，对甲型H1N1流感病毒具有明显的抑制作用。这为将鹅干扰素-α用于治疗病毒感染提供了新的途径。
关键词：鹅干扰素-α；毕赤酵母；分泌表达；抗病毒活性；甲型H1N1流感病毒
引言
干扰素（interferon，IFN）是一类具有多种生物作用的蛋白质，能够抑制病毒复制和细胞增殖，促进机体免疫反应。其中，干扰素-α（interferon-α，IFN-α）是糖蛋白家族中重要的一员，在治疗白血病、乙肝、肝癌等疾病中具有广泛的临床应用价值。然而，目前常用的来源于人源的IFN-α成本较高，而动物源的IFN-α具有更好的临床效果。鹅干扰素-α（interferon-αfromgoose，IFN-αg）是一种新型的干扰素，不仅在构象上与人源IFN-α有所不同，而且在抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等方面表现出独特的活性，受到了越来越多的关注。
毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种常用的真菌表达系统，具有高效、安全、简便等优点，已被广泛应用于人类蛋白质的表达。本实验旨在利用毕赤酵母表达IFN-αg，并研究其在毕赤酵母中的分泌表达和抗病毒活性。
材料与方法
重组蛋白表达载体构建
通过PCR扩增得到IFN-αg的基因序列，并将其插入pPICZαA载体中，经过线性化处理后导入毕赤酵母细胞中。
毕赤酵母发酵
采用Shake-flask发酵法进行IFN-αg的表达。首先，将毕赤酵母细胞转化后在MD缓冲液中进行预培养，然后转移到BMGY液提供细胞生长所需的营养物质。待到细胞密度达到一定程度后，加入BMMY液，同时添加MeOH诱导表达。经过一定时间后，取出进行离心，采集培养基和沉淀物进行进一步的分析。
SDS-PAGE分析
采用SDS-PAGE方法分析毕赤酵母表达的IFN-αg。取出培养基样品，经过蛋白质的提取、电泳和染色等处理步骤，然后进行凝胶切割、洗涤和蛋白质结构鉴定等实验操作。
生物活性测定
通过细胞增殖抑制实验（CPE）的方法，检测IFN-αg对甲型H1N1流感病毒的抑制作用。取不同浓度的IFN-αg加入细胞培养基中进行培养，然后加入感染了甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞，检测细胞的增殖和病毒复制情况。
结果
毕赤酵母进行IFN-αg表达后，成功获得了高表达的重组蛋白。经过SDS-PAGE分析，可以看到培养基中出现了一条分子量约为22kDa的蛋白条带，与理论值相符，同时，电泳图显示这些蛋白物质呈现出单一的、均一的样带，表明IFN-αg在毕赤酵母中被成功地表达和分泌。
为了评估IFN-αg在毕赤酵母中的活性，采用CPE实验检测其抗病毒和细胞增殖抑制情况。实验结果表明，IFN-αg对甲型H1N1流感病毒具有明显的抑制作用，IC50浓度为10IU/ml，但对正常细胞的影响非常小，表明IFN-αg具有较好的生物活性和疗效。
讨论
本实验成功利用毕赤酵母表达了高效、高产IFN-αg，并对其进行了生物活性的检测。当前干扰素类药物在抗病毒和抗肿瘤方面的临床应用前景非常广阔，因此开发一种生产IFN-αg的生物制剂具有非常重要的临床意义和应用价值。使用毕赤酵母表达IFN-αg可以在避免使用动物细胞的同时提供了一个更快、更高效的表达系统，本实验得到的优异结果表明，该方法具有较高的潜力。
结论
本实验成功构建了鹅干扰素-α基因的pPICZαA载体，并利用毕赤酵母表达系统制备了高效、高产的重组IFN-αg。通过SDS-PAGE分析和CPE实验，结果表明该方法可以实现IFN-αg的高效表达，且表现出良好的抗病毒和细胞增殖抑制活性，为该生物制剂的研究和生产提供了新的方法。