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重组survivin腺病毒对喉癌细胞抗凋亡作用的体外实验研究
喉癌是一种常见的恶性肿瘤，常常表现为喉咙的肿瘤和肿块。该病的发病率在近年来呈逐年上升趋势，对于患者的健康造成了极大的威胁。治疗喉癌的方法很多，包括放疗、化疗、手术切除等，但是这些治疗方法都存在着一些副作用，因此需要寻找更为安全有效的治疗方法。
近年来，基因治疗逐渐成为治疗各种疾病的热点，其中利用重组腺病毒进行基因治疗已经成为一种十分有前途的治疗手段。Survivin（存活素）是一种表达于多种癌细胞的特异性抑制凋亡原型蛋白，其在多种恶性肿瘤的发生、发展以及预后方面均发挥着重要作用。因此，可以通过去除survivin基因或抑制其表达来达到抗癌的目的。然而，由于survivin在正常细胞中也具有重要生理功能，因此需要使用特异性较好的基因传递载体对survivin进行调控，以降低基因治疗的副作用。
本研究对重组survivin腺病毒对喉癌细胞抗凋亡作用进行了体外实验研究，以下详细描述实验过程和结果。
实验方法
1.细胞培养
喉癌细胞株KSCC-HEp-2采用离体培养的方法进行培养。将切碎的肿瘤组织块放在含有胶原酶（0.1%）的PBS溶液中，用力搅拌10min，使细胞分离。离心后，将洗涤过的细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养，放在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。
2.病毒构建
采用PCR技术扩增出survivin基因完整序列，并通过限制性酶切将survivin基因与腺病毒质粒载体pAdTrack-CMV连接，并转化质粒到E.coli中，进行提取纯化。采用质粒转染法将survivin基因与AdEasy-1腺病毒质粒荧光标记质粒共转染到293A细胞中，生成重组腺病毒rAd-survivin。
3.MTT实验
取培养好的KSCC-HEp-2细胞50ul，接种在96孔板上，使其在孔中表面均匀涂布。根据计划分组分别加入不同浓度的重组腺病毒rAd-survivin（MOI为0、10、20、50、100），每组设3孔。培养36小时后，将100ulMTT溶液加入孔中并再次恒温培养4小时，吸取液体，将150μlDMSO溶液加入孔中震荡10min，检测OD值，制作KSCC-HEp-2细胞与rAd-survivin的抑制曲线。
4.FlowCytometry实验
将KSCC-HEp-2细胞分别接种于6孔板内(1×10^5细胞/孔)，接种后，将重组腺病毒rAd-survivin加入后不同时间点（0h，12h，24h，36h）收集细胞进行流式细胞分析（FCM）。采用Annexin-V-PE/APC双标记方法检测细胞凋亡，分别测量细胞的生存率、早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率。
实验结果
1.细胞的抑制曲线
实验结果显示，随着rAd-survivin的MOI的增加，细胞的抑制率也逐渐增加，说明重组腺病毒rAd-survivin能够对KSCC-HEp-2细胞产生抑制效果，并具有剂量依赖性。
2.FlowCytometry实验结果
实验结果显示，与对照组相比，rAd-survivin处理组的生存率明显下降，早期凋亡率明显增加，晚期凋亡率和坏死率也明显增加（P<0.05），表明重组survivin腺病毒对喉癌细胞具有显著的抗凋亡作用。
结论
本实验研究表明，重组survivin腺病毒能够明显抑制喉癌细胞的生长，且具有明显的抗凋亡作用。这为基因治疗喉癌提供了新的思路，并为临床上应用该技术提供了实验依据。但是，应该注意到，该研究仅为体外实验，其临床价值需要进一步探究。因此，未来应该深入地研究基因治疗与喉癌治疗的潜力和安全性，为喉癌患者寻找一种更为有效、安全的治疗方法。