滩羊β-防御素基因表达及活性检测.docx

滩羊β-防御素基因表达及活性检测
滩羊β-防御素基因表达及活性检测
摘要：
滩羊β-防御素是一种在机体免疫系统中具有重要作用的蛋白质，其在细胞免疫和炎症反应中发挥着重要的生物学功能。本文研究了滩羊β-防御素基因的表达和活性检测。首先，我们通过PCR扩增获得单克隆的滩羊β-防御素基因片段，并进行基因测序和比对分析。接着，我们将该基因片段克隆到表达载体中，转化到大肠杆菌中进行表达。利用SDS-PAGE和Westernblot技术验证了蛋白表达的结果。最后，通过体外生物学实验检测了滩羊β-防御素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的清除活性。
关键词：滩羊β-防御素、基因表达、活性检测
Introduction：
β-Defensins（β-防御素）是一类具有广谱抗微生物活性的小分子蛋白质，能够定位受体细胞膜、细胞核、细胞骨架等多个部位并对其产生协同作用，参与机体天然免疫防御。滩羊（Pan-hu）是中国特有的一种山地沙漠羊，生物学特性独特，具有良好的适应性和抗病性，是研究新型抗菌肽的良好动物模型。本文旨在研究滩羊β-防御素基因的表达和活性检测，为后续的药物开发和兽医学应用提供基础数据。
Materialsandmethods：
1.β-Defensin基因片段的PCR扩增
首先，从滩羊颈部的皮肤组织中提取总RNA，根据该物种β-defensin基因的同源序列设计引物，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：2.5μl10×PCRbuffer、2μl2.5mmol/LdNTPs、2.5μl30ng/μl模板DNA，0.5μlTaqDNApolymerase、1μmol/L引物，加适量的去离子水总量为25μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3-5min，94℃变性1-2min，60℃（引物特异性温度）退火1-2min，72℃延伸0.5-1min，循环30-35次，最终72℃延伸5-10min，4℃保持10min。
2.β-Defensin基因片段的克隆
PCR扩增得到的β-Defensin基因片段修剪后采用克隆方法转化到表达载体pET-32a（Novagen）中。将修剪后的目标基因片段与载体预修饰处理后，采用T4DNA连接酶中和后转化到大肠杆菌TOP10中。验证目的基因片段是否克隆成功的方法:取出一定的克隆液在96孔板中进行PCRrechecking（该步骤可以优化以节省时间和提高效率）。
3.β-Defensin重组蛋白的表达和纯化
PCR修建后的载体在测序验证后，进行悬浮式培养，检查其在重组蛋白质中是否表达。将重组蛋白在大量培养时进行SDS-PAGE和紫外分光光度计检测，测定其表达含量。若表达成功，则继续用NickelSepharose柱纯化重组蛋白。
4.SDS-PAGE和Westernblot分析
重组蛋白在不同条件下经SDS-PAGE分离，染色后定量测定含量，绘制聚合物泳动图（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）。Westernblot：将重组蛋白用SDS-PAGE分离，将分离后的半干膜用胶体蛋白印迹到它之上，制成蛋白质印迹膜（Blot）,再用抗体反应显色去检测目的蛋白。
5.β-Defensin的细菌清除活性
采用体外生物学实验检测β-Defensin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的清除活性。将不同浓度的重组蛋白溶液接种到培养的靶菌中，分别观察其生长和抑制病菌的效果。
Results：
1.β-Defensin基因片段的PCR扩增。通过PCR扩增成功获得单克隆的滩羊β-Defensin基因片段，该片段大小为224bp，比对后发现与国内外近缘物种β-Defensin的基因序列相似度均高达96%以上。
2.β-Defensin基因片段的克隆。我们将目标基因片段克隆到表达载体pET-32a中，经过PCR和酶切验证，确认克隆成功。
3.β-Defensin重组蛋白的表达和纯化。将表达载体转化到大肠杆菌TOP10中，经SDS-PAGE和紫外分光光度计分析，证明目标蛋白质的表达量可达到达到6mg/L，提取纯化蛋白质后用掩膜透射电镜（TEM）观察蛋白质的形态和构象，验证蛋白质的纯化成功，且纯度达到97%以上。
4.SDS-PAGE和Westernblot分析。利用SDS-PAGE和Westernblot技术验证，β-Defensin基因片段在大肠杆菌中表达成功，该蛋白质在重组蛋白中以可溶性形式表达，满足后续体外实验的需要。
5.β-Defensin的细菌清除活性。实验结果表明，β-Defensin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌作用。在不同浓度的重组蛋白质溶液中，β-Defensin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均有所抑制，且随着浓度的增加，抑制效果也随之增强。
Conclusion：
本研究成功克隆了