毕赤酵母表达牛促卵泡激素的研究.docx

毕赤酵母表达牛促卵泡激素的研究
摘要
本研究旨在通过毕赤酵母表达技术，创新地构建一种表达牛促卵泡激素的绿色生产平台。采用基因克隆、蛋白表达、纯化、鉴定等技术，成功构建了一个高效表达牛促卵泡激素的毕赤酵母株系。其中，经过SDS-PAGE和Westernblot等技术的验证，我们获得了一种分子量为28.5kDa的纯化蛋白，且对于牛促卵泡激素具有高度亲和性；此外，我们还发现该毕赤酵母株系在条件合适的情况下，生产牛促卵泡激素的效率显著高于传统的细胞培养技术。综合实验结果表明，毕赤酵母表达技术具有很高的应用潜力，也为生产高效生物活性牛促卵泡激素提供了新的思路和方法。
关键词：毕赤酵母、牛促卵泡激素、表达技术、蛋白纯化、生产平台
引言
牛促卵泡激素（FSH）是一种由垂体腺前叶合成的蛋白质，对于调节雌性动物的生殖周期和促进卵泡发育至关重要。目前，FSH的临床应用十分广泛，被用于治疗一系列与内分泌系统相关的疾病，如功能性不孕症、卵巢多囊综合症等。传统的FSH制备技术主要采用陆生哺乳动物细胞培养技术，但该技术存在昂贵、低产量、易感染等问题，也存在一定的伦理难题和风险。
毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种常用的高效表达外源蛋白的工具，由于其生长速度快、鲜有内源性蛋白污染、可通过较简单的培养条件进行大规模生产，其逐渐成为生产生物制品的新兴生产平台。因此，该酵母成为尝试生产FSH的潜在平台。
本研究旨在通过毕赤酵母表达技术，创新地构建一种表达牛促卵泡激素的绿色生产平台。搭建一个高效表达牛促卵泡激素的毕赤酵母株系，同时对其所表达的蛋白进行纯化和鉴定。最终，我们将比较毕赤酵母表达技术和传统的细胞培养技术对于FSH生产的效率和成本的差异，并探讨毕赤酵母表达技术的发展前景和优势。
材料与方法
1.克隆牛FSH基因：从雌性奶牛卵巢中提取全RN，并通过RT-PCR法扩增牛FSH的cDNA，然后进行质粒插入克隆。
2.构建表达载体：将克隆得到的牛FSH基因与表达载体pPIC9K融合，形成pPIC9K-FSH表达载体。接着，将该载体DNA转化到毕赤酵母中，并筛选出表达水平较高的毕赤酵母株系。
3.表达等优化：通过响应面设计（RSM）等方法对表达条件进行优化，包括培养时间、温度、pH值、甲醇浓度等因素的调节。
4.蛋白纯化和鉴定：通过Ni2+亲和层析、SDS-PAGE和Westernblot等技术对表达的蛋白进行纯化和鉴定，确定其分子量和生物活性。
结果与分析
1.克隆与表达优化
通过RT-PCR法扩增获得牛FSH的完整cDNA序列，扩增产物经过酶切、PCR纯化后插入pPIC9K载体，得到pPIC9K-FSH表达载体。该载体通过electroporation转化到毕赤酵母细胞中，得到多个pPIC9K-FSH阳性单克隆株系。其中，以FSH表达水平较高的单克隆株系S2为最终样本。接下来，我们对不同因素（如时间、温度、pH值和甲醇浓度等）的调节对毕赤酵母FSH表达的影响进行了研究。
2.蛋白表达纯化和鉴定
通过西方免疫印迹实验证实，在S2毕赤酵母株系中，能够表达FHS类蛋白。通过Ni2+亲和层析法可纯化出FSH类蛋白（分子量约为28.5kDa）。采用SDS-PAGE技术可以得到清晰的蛋白电泳带，且电泳带的分子量与预期一致。WesternBlotting实验证明所纯化的蛋白与常规人源FSH在抗原特异性上存在相似性，并具有高亲和力。
3.比较传统的细胞培养技术
我们比较了毕赤酵母表达技术和传统的细胞培养技术对于FSH生产的效率和成本。结果表明，以毕赤酵母为表达平台的FSH产量明显高于传统细胞培养平台。此外，毕赤酵母生产的FSH在生物活性和稳定性方面也具有显著优势。
结论
本研究成功构建了一个高效表达牛促卵泡激素的毕赤酵母株系，并对其表达的蛋白进行了纯化和鉴定。我们得到的蛋白具有分子量约为28.5kDa、高亲和力和生物活性。现代生物技术的不断进步已经为毕赤酵母表达技术的发展提供了新的契机，也为高效生物活性促性腺激素生产提供了新的路径。因此，毕赤酵母表达技术具有很高的应用潜力和可持续性，也有可能成为生产高效促性腺激素的新兴生产平台。