拟南芥在毕赤酵母中的表达.docx

拟南芥在毕赤酵母中的表达《生物工程学报杂志》2014年第六期1材料与方法1.1材料1.1.1菌种和质粒大肠杆菌DH5α为本实验室保存；宿主菌毕赤酵母GS115、质粒pPICZαA购自Invitrogen公司。1.1.2试剂及仪器拟南芥ArabidopsisthalianacDNA为山东大学微生物国家重点实验室所赠；Taq酶、DNA连接酶、限制酶均购自大连宝生物公司；DNA柱纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；DNA及蛋白标准分子量、质粒提取试剂盒以及T载体购于北京全式金公司；LB培养基、YPD培养基均按照Invitrogen公司毕赤酵母表达手册配制；其他试剂为国产和进口分析纯试剂。所用仪器：2720ThermalCyclerPCR仪；国产DYY-12电泳仪；Bio-RadGenePulserⅡ电转化仪；岛津GCMS-QP2010气质联用仪。1.1.3引物据拟南芥硫酯酶基因AtFatA(GenBank:AK176105)设计引物上游、下游引物分别命名为P1、P2并分别引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点(下划线)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。1.2方法1.2.1PCR反应获取目的片段以拟南芥的cDNA作为模板进行PCR扩增。反应条件：94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃2min；30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行柱回收。1.2.2构建重组T载体pEASY-Blunt-AtFatA将T载体及上述PCR反应所得基因产物分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应胶回收基因片段和相同酶切的T载体按照一定比例连接得到重组T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并将其涂布于含有30µg/mLZeocin抗性平板37℃恒温箱隔夜培养蓝白斑筛选用灭菌牙签挑取抗性单克隆菌落分别以P1、P2作上、下游引物进行菌落PCR初步验证。按对应序号在同浓度Zeocin抗性低盐LB培养基中扩培提取重组T载体酶切二次鉴定然后将通过验证的重组T载体送至上海生工测序最终验证。1.2.3重组质粒pPICZαA-AtFatA的构建摇菌并提取、纯化重组T载体、pPICZaA质粒对二者分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应胶回收AtFatA基因片段和相同酶切的pPICZαA质粒按照一定比例连接得到重组质粒后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(图1)然后按照1.2.2中重组T载体的操作方法对其进行抗性筛选；37℃隔夜培养后见白色菌落。进一步对所构建的重组质粒pPICZαA-AtFatA进行如上重组T载体的三步验证确保重组质粒构建成功以及所携目的基因的精确。1.2.4重组质粒pPICZαA-AtFatA的转化和鉴定将提纯的pPICZαA-AtFatA质粒用SacⅠ限制酶单切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞涂布于含有120µg/mLZeocin的YPDS平板30℃培养4−6d筛选到阳性转化子。同浓度ZeocinYPD培养基扩培后提取重组菌的基因组以P1和P2为引物进行PCR鉴定同时以转化过空载体的菌株作空白对照。1.2.5外源蛋白的诱导表达与检测挑取Mut+重组子接种至含50mLBMGY培养基的500mL三角瓶中30℃、250r/min振荡培养20h；3000r/min离心5min弃去上清再以50mLBMMY重悬菌体；菌液置于500mL挡板瓶中用四层纱布封口28.5℃、250r/min振荡培养诱导表达；每24h向培养基中添加除菌的无水甲醇使其终浓度为0.5%诱导72h收集发酵物。取少量发酵产物离心收集发酵上清液与发酵既得菌体。在缓冲液保护下将菌体破壁、3000r/min离心5min处理保留上清。同时取野生菌进行相同发酵条件及后期处理以作空白对照。用SDS-PAGE法分别对发酵上清液和破壁离心后菌体上清液进行蛋白检测。1.2.6胞外游离脂肪酸的检测用气质联用法(GC-MS)检测胞外游离脂肪酸种类及含量进而间接评估外源硫酯酶蛋白活性。将1.2.5中的发酵上清液进行脂肪酸甲酯化处理处理方法参考文献[17]。GC-MS色谱条件：毛细管柱为DB-5MS载气为高纯氦气(99.999%)进样器温度230℃检测器温度250℃载气柱头压65.2kPa。程序升温条件：初始温度90℃保持3.5min5℃/min升至250℃保持5min。分流比设定为1：30每次进样量为1μL。2结果与分析2.1目的基因扩增以拟南芥的cDNA作为模板由PCR扩增得到约1200bp的目的片段大小与拟南芥硫酯酶基因预测值相符说明目的