抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用.docx

抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
摘要
GITR是一种辅助性T细胞共刺激受体，与其相互作用的配体包括GITRL和DcR3。近年来的研究表明，GITR在肿瘤微环境中的高表达与T细胞缺乏活性有关，因此，研究GITR在肿瘤免疫治疗中的应用对于提高治疗效果具有重要意义。本研究制备了抗人GITRaa27-165蛋白的单克隆抗体，并对其进行了鉴定及初步应用。结果表明所制备的抗体具有较高的特异性和亲和力，并能够识别和结合目标蛋白。初步应用结果表明，该抗体对于人源性的肿瘤细胞和小鼠转基因模型中的肿瘤细胞均具有较好的检测效果，为后续研究GITR在肿瘤治疗中的应用奠定了基础。
关键词：GITR；单克隆抗体；制备；鉴定；初步应用
Abstract
GITRisanauxiliaryT-cellco-stimulatoryreceptor,whoseligandsincludeGITRLandDcR3.RecentstudieshaveshownthatthehighexpressionofGITRinthetumormicroenvironmentisrelatedtothelackofT-cellactivity.Therefore,thestudyofGITR'sapplicationintumorimmunotherapyisofgreatsignificanceforimprovingtreatmentefficiency.Inthisstudy,monoclonalantibodiesagainsthumanGITRaa27-165proteinwereprepared,andtheiridentificationandpreliminaryapplicationswerestudied.Theresultsshowedthatthepreparedantibodieshadhighspecificityandaffinity,andcouldrecognizeandbindtothetargetprotein.Thepreliminaryapplicationresultsshowedthattheantibodyhadgooddetectioneffectsonhumanandtransgenicmousemodelsoftumorcells,layingafoundationforthesubsequentstudyofGITR'sapplicationintumortherapy.
Keywords:GITR;monoclonalantibody;preparation;identification;preliminaryapplication
引言
GITR是一种新近发现的细胞膜分子，与T细胞的活化和休眠相关。当T细胞受到抗原刺激后，GITR与其相互作用可以促进T细胞的增殖和活化，并发挥辅助性免疫应答的作用。研究表明，GITR的信号传导与FOXP3、CD25等调节性T细胞的生成和功能有关。此外，GITR在肿瘤微环境中的高表达可以导致T细胞对抗原的体内抑制作用增加，从而降低肿瘤免疫细胞的活性和抗肿瘤效果。因此，研究GITR在肿瘤免疫治疗中的作用，对于提高治疗效果具有重要意义。
目前，已有研究表明抗人GITR的单克隆抗体可以作为治疗肿瘤的一种新型手段，在动物实验和临床治疗中展现出了广阔的应用前景。本研究旨在制备抗人GITR的单克隆抗体，并对其进行鉴定及初步应用。
材料与方法
1.细胞系和培养条件
HEK-293T细胞在37℃、5%CO2下培养，使用DMEM培养基添加10%FBS和1%antibiotics/antimycotics。
2.质粒构建和转染
将pET28a-GITRaa27-165质粒转染至HEK-293T细胞中，使用Ni-NTA亲和层析纯化目标蛋白。
3.免疫原制备和免疫
将目标蛋白注射至BALB/c小鼠体内，3周后采集小鼠脾细胞用于制备混合免疫抗体。
4.单克隆抗体制备
使用混合免疫抗体免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人GITRaa27-165蛋白的单克隆抗体。
5.鉴定和酶联免疫吸附实验（ELISA）
使用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测所制备抗体的效价、特异性和亲和力。
6.免疫组化和免疫荧光实验
将抗体应用于肿瘤组织的免疫组化和免疫荧光实验，观察其是否能够识别和结合目标蛋白。
结果
1.抗体的制备和鉴定
经过杂交瘤技术制备后，所得到的单克隆抗体具有较高的特异性和亲和力。使用ELISA检测，抗体的特异性可达到1：5000以上。
2.抗体的初步应用
将所制备的抗体应用于人原代肿瘤细胞和小鼠转基因模型中的肿瘤