抗HIV1 Tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定.pdf

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抗HIV1Tat蛋白单克隆抗体的制备及初
步鉴定

（作者:___________单位:___________邮编:___________）

【摘要】目的:制备抗HIV1Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）,

并对其进行初步鉴定。方法:通过动物免疫、细胞融合、克隆化制

备抗Tat蛋白的mAb,并用ELISA法对所得mAb的特异性、抗原

识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。结果:获得了3株抗Tat蛋

白的mAb,这3株mAb均能特异识别Tat蛋白。结论:获得了3株

杂交瘤细胞系,均可以稳定分泌抗HIV1Tat蛋白的mAb,有望为

HIV早期检测及HIV抗病毒治疗提供有用工具。

【关键词】HIV1Tat单克隆抗体

自1981年发现艾滋病以来,艾滋病（acquired

immunodeficiencydisease,AIDS）在全球迅速扩散,人免疫缺陷病

毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）是引起AIDS的病原体。

HIV有许多结构蛋白以及调节蛋白,其中Tat蛋白是很重要的调控蛋

白之一,是HIV基因复制和表达调控所必需的［1］。Tat蛋白由2个
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外显子编码,其中第1个外显子编码l～72位氨基酸残基,第2个外

显子编码73～101位氨基酸残基。由第1个外显子编码的72个残基

的肽段具有完全的体外反式激活活性。Tat是HIV最早产生的病毒蛋

白之一,其入核后通过结合HIV长末端重复序列和反式激活效应元

件,进一步促进病毒RNA的产生,是病毒复制的重要激活分子［2］。

本研究中通过免疫BALB/c小鼠获得Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）,

并用ELISA等方法检测mAb的性质,为HIV早期检测以及抗病毒治

疗提供了新的思路。

1材料和方法

1.1材料

纯化的Tat蛋白由美国丹佛大学惠赠。BALB/c小鼠（6～8周

龄）购买第四军医大学实验动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为本

试验室保存。RPMI1640干粉培养基购自Gibco公司。小牛血清购自

四季青公司。酶标山羊抗小鼠IgG抗体购自TaKaRa公司。小鼠Ig

亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1动物免疫

取Tat蛋白28μL,加0.02mol/L的PBS(pH7.4)1.472mL使

成1.5mL浓度溶液,加等量福氏完全佐剂用三通器混匀制成油

包水的乳化液。在5只BALB/c小鼠的颈背部及双侧腹股沟皮

下多点注射,剂量为0.6mL/只,间隔3周后以同样方法(加不完全福

氏佐剂乳化)免疫,再间隔2周后取等量蛋白溶于生理盐水中经腹腔
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进行第3次免疫,最后1次免疫2周后测小鼠血清效价,选择血清效

价高的小鼠再经腹腔加强免疫,3d后取脾细胞进行融合。

1.2.2mAb细胞株的建立

取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,融合剂为相

对分子质量（Mr）1500的PEG。细胞融合及选择性培养均按常规

方法［3］进行。以10mg/L的Tat蛋白包被聚苯乙烯微板,用间接

ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清,以正常BALB/c小鼠血清作为阴

性对照,以免疫BALB/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对

检测阳性孔细胞进行3次克隆化,直到克隆生长孔mAb阳性率达

100％,建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后液氮冻

存。

1.2.3mAb腹水的制备及其效价测定

取建株的杂交瘤细胞扩大培养后,以1×106个细胞接种于已注

射石蜡油的BALB/c小鼠腹腔中,按常规法收集、制备mAb腹水

［3］。以上述间接ELISA法检测mAb腹水效价。

1.2.4mAb的纯化

采用正辛酸硫酸铵法对小鼠腹水中的mAb进行纯化［3］。

1.2.5mAb的特异性鉴定不同多肽检测mAb腹水

分别取Tat、Gp415多肽及Bcsp31蛋白,以20mg/L浓度包

被微板,用间接ELISA法检测抗Tat蛋白的mAb腹水(分别以正常鼠

血清为阴性对照)。

1.2.6Ig类和亚类的鉴定
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采用小鼠Ig类检测试剂盒对所获得的mAb进行鉴定,具体方

法参照试剂盒中的说明书进行。

1.2.7mAb相对亲和力的测定

采用间接ELISA法测定［4］。以10mg/L的浓度包被Tat蛋白,

加入系列稀释(200mg/L至10-8mg/L)的纯化mAb,再加入HRP标

记的羊抗鼠IgG,OPD显色后测定492nm处的A值。以抗体浓度为

横坐标,以A492为纵坐标,绘制曲线