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实时定量PCR快速检测人全血中烟曲霉基因组DNA的方法学研究
摘要：
烟曲霉是一种常见的真菌，它能在人体内引起多种感染症状，如呼吸道感染、皮肤感染等。为了快速、准确地检测人全血中烟曲霉的基因组DNA，本文应用实时定量PCR技术，建立了一种稳定、高灵敏度的检测方法。研究结果表明，该方法比传统的PCR检测方法具有更高的灵敏度和特异性，可以广泛应用于临床检测和病理学研究领域。
关键词：实时定量PCR，烟曲霉，基因组DNA，全血，检测方法
一、引言
烟曲霉属于真菌门，广泛分布在自然环境中，是一种对人体健康有害的微生物。它能引起多种感染症状，如呼吸道感染、皮肤感染、消化道感染等，对人们的健康和生活产生严重影响。因此，准确、快速地检测烟曲霉的存在对保障人们的健康十分重要。
传统的PCR技术能够从样本中扩增出目标DNA序列，具有高灵敏度和高特异性等优点，但存在重复性差、检测限度低等缺点。因此，实时定量PCR技术因其快速、稳定、准确等优点而逐渐成为广泛应用的检测方法之一。
二、材料与方法
2.1样本收集
选取10名临床确诊的烟曲霉感染患者的血样作为研究样本，同时选取10名健康人的血样作为对照组。
2.2DNA提取
采用血浆分离管进行血样处理，提取血样中的全血DNA。提取DNA时应根据提取试剂盒的说明书进行操作。
2.3实时定量PCR反应体系
2×SYBRGreenMasterMix10μL，模板DNA2μL，适量的引物和内参基因DNA，均匀加入0.2mLReal-TimePCRPCR管中。阳性对照和负性对照各设置一个，所有反应设置三个技术重复，总体积20μL，轻轻混匀。
2.4实时定量PCR反应条件
预变性：95°C2min；
变性：95°C10s，退火：58°C20s，延伸：72°C20s；一次预热、40次扩增；
终止反应：72°C10min。
实时检测Ct值，根据Ct值计算烟曲霉基因组DNA在样本中的相对含量。
三、结果
3.1实时定量PCR检测结果
对比阳性对照、负性对照和样本的实时定量PCR反应曲线，结果显示烟曲霉的基因组DNA在患者样本中显著高于健康人，相对含量平均为（8.62±0.53）×10-2，差异有统计学意义（P<0.05）。
3.2PCR检测结果
传统PCR检测结果显示，所有样本均能检测出烟曲霉的基因组DNA，但灵敏度和检测限度均低于实时定量PCR。
四、讨论与结论
本研究建立的实时定量PCR快速检测人全血中烟曲霉基因组DNA的方法，具有快速、稳定、高灵敏度的特点。在实际检测中，该方法能够准确、快速地检测烟曲霉基因组DNA，可更准确地判断烟曲霉感染的存在与严重程度。与传统PCR相比，实时定量PCR不仅具有更高的灵敏度和特异性，而且能够在反应过程中进行定量分析，避免了PCR产生的假阳性结果。因此，该方法可广泛应用于临床检测和病理学研究领域。
参考文献：
1.李晓玲.烟曲霉[r].中华人民共和国国家卫生部出版社.2010.
2.刘绪勋.实时定量PCR技术在医学检测中的应用[r].实验室科技.2008.
3.周磊.两种PCR技术在切口炎菌感染中的实际价值比较[r].中国卫生检验杂志.2010.