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A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用
论文题目：A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用
摘要：禽白血病是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）引起的一种重要传染病，它对畜禽养殖业造成了极大的经济损失。常用的ALV检测方法包括PCR、ELISA、病毒分离等技术，但这些方法需要设备昂贵、操作复杂、耗时长等问题。为了建立一种简便快捷、灵敏度高的检测方法，本研究采用LAMP技术，成功建立了一种A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法，其灵敏度及特异性均较高，并且能够有效地应用于临床样本检测。
正文：
一、引言
禽白血病是家禽中比较常见的传染病之一，其主要传播方式为垂直传播和水平传播，对家禽养殖业的可持续发展造成了很大的经济损失。现有的ALV检测方法主要包括PCR、ELISA、病毒分离等技术，但这些方法不但需要昂贵的设备、试剂，而且操作复杂，不适合于大规模的样本检测。LAMP技术已经成为一种颇受关注的新型核酸检测技术，其操作简单、耗时短、无需昂贵设备等特点，成为了快速检测ALV的新方法。因此，本研究旨在建立一种A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法，以期提高ALV的检测精准度及检测效率。
二、材料与方法
2.1实验材料
ALV基因序列（A、B亚群）、LAMP试剂盒（EikenChemicalCo.，Ltd.）、酶标仪（Bio-RadInc.）、PCR仪（EppendorfAG）、超微量分光光度计（ThermoScientific）、禽血样、组织样。
2.2LAMP反应体系及反应条件
反应体系：25μL反应体系包括LAMPMasterMix（12.5μL，含有D2，F3，B3，B2和FIP/BIP引物，及循环酶）、离子交换酸性聚合物、MgSO4、DNA模板、ddH2O。
反应条件：反应温度65℃，反应时间60min。
2.3ALVLAMP检测方法的建立
2.3.1病毒分离、提取RNA
将野生家禽血、组织样按照传统方法进行病毒分离以及血清或者血浆、细胞分离液等样品可根据RNA温和提取方法提取RNA。
2.3.2基因序列及引物设计
以GenBank数据库中已有的A、B亚群ALV全基因序列作为参考目标，选择一段关键性区域的序列对应的引物，通过引物设计软件进行设计引物。（参考文献有关）
2.3.3LAMP反应体系构建和优化
根据设计引物组合配置LAMP反应体系，并进行温度梯度实验，以确定最佳放大温度及最佳实验条件，完成LAMP体系稳定性及效果优化。
2.3.4LAMP灵敏度检测
2.3.4.1细胞系稀释法
选用A、B亚群ALV阳性细胞系，按1:10稀释系列递减，取1mL悬液进行LAMP检测。
2.3.4.2RNA定量法
采用曲线法，将已知浓度的RNA逐级稀释，以最低灵敏度作为检测极限，计算出LAMP最低检测线性。
2.3.5LAMP特异性检测
对其他家禽病毒如禽瘟、喜乐病毒等，进行特异性检测，确定LAMP反应的特异性。
2.4初步应用
对35批采自不同地区的家禽样本进行LAMP检测，结果与PCR检测结果对比分析。
三、结果与分析
3.1建立A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法
根据LAMP反应体系搭建最佳实验条件，构建了A、B亚群ALVLAMP检测方法。LAMP反应的基因靶序列是ALV清鸡毒WD5E。经过标准样品的检测，ALVLAMP方法的检测灵敏度达到10-2TCID50/mL，最低检测限达到100TCID50/mL。
3.2LAMP灵敏度检测
针对2.3.4.1及2.3.4.2的方法，ALV真核细胞系1:10系列递减检测结果显示，A、B亚群ALV样本均能够被检测到，LAMP反应的最低检测线性相对标准曲线的线性区域达到了100TCID50/mL以下；在RNA定量法检测结果中，LAMP方法最低检测限可达到10fg/μL。
3.3LAMP特异性检测
针对2.3.5的方法，本实验检测到其他禽病毒，如禽链球菌、禽瘟病毒、鸽传染性感冒病毒、传染性法氏囊炎病毒、禽流感病毒、Marek’s病毒、造血减少症病毒、传染性支气管炎病毒，这些病毒中都无LAMP反应的信号，提示本实验ALVLAMP检测方法具有良好的特异性。
3.4LAMP方法在不同地区家禽样本的应用
应用ALVLAMP方法，共检测35批不同地区采自家禽样本，结果分别与PCR检测结果进行比较，发现ALVLAMP方法检测的A、B亚群ALV阳性数与PCR方法检测结果一致。
四、结论与展望
综上所述，本研究成功建立了一种A、B亚群ALVLAMP检测方法，该方法灵敏度高、特异性好，操作简单，操作成本低，可广泛应用于禽白血病的快速检测中，将有望成为ALV的主要检测方法之一。当然，LAMP方法也存在一些缺陷和未知的限制因素，如反应时间太长等，我们后续可以通过