大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3的表达纯化任务书.docx

大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3的表达纯化任务书
任务书
一、任务概述
本任务需要对大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3进行表达和纯化，为进一步的功能和结构研究提供有力支持。
二、任务内容
1.基因克隆
本任务需要基于已有的大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3的基因序列信息，设计引物对目标基因进行扩增。扩增后的产物需要经过酶切，后与相应的表达载体连接，并进行测序验证。
2.表达
将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)和铜绿假单胞菌PAO1中，根据前人经验优选适宜的培养条件进行表达。
3.细胞破裂液制备
从培养后的大肠杆菌和铜绿假单胞菌中，采用超声波或者高压细胞破碎仪进行细胞破裂，制备含有目标蛋白的细胞破裂液。
4.离子交换层析
通过离子交换层析对破裂液上清液进行初步纯化，去除噪音与杂质。优化离子交换层析参数，包括洗脱条件等，以期得到良好的分离并提高目标蛋白的纯度。
5.凝胶过滤
将经离子交换层析后的目标蛋白溶液进行凝胶过滤，去除了解离子交换不足的组分，提高纯度。
6.亲和层析
本任务采用亲和层析法对目标蛋白进行纯化。初步试验需要优选备选配体，确立适宜的洗脱条件，并进行探索具体所需的具体重构联体。
7.SDS-PAGE分析
采用SDS-PAGE对纯化后的大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3进行鉴定。利用蛋白质电泳技术进行分离，确定纯度。
三、时间安排
1.基因克隆：4周
2.表达：4周
3.细胞破裂液制备：1周
4.离子交换层析：3周
5.凝胶过滤：2周
6.亲和层析：4周
7.SDS-PAGE分析：1周
四、设备要求
1.分子生物学实验设备：PCR仪、聚合酶、电泳系统、蛋白质电泳仪等。
2.培养设备：细胞培养箱、转速计等。
3.细胞破碎设备：超声波破碎仪或高压细胞破碎仪等。
4.层析设备：离子交换柱、凝胶过滤柱、亲和柱等。
5.转化设备：电穿孔装置等。
6.其他检测设备：UV可见光谱仪等。
五、人员要求
本任务需要具备相应的生物学、生物化学或相关专业的本科或者以上学历，并熟练掌握所需实验技能和装置的操作。要求实验者具备责任心，注重实验细节、精度和安全。
六、实验预算
本任务所需实验材料、试剂及设备共计：100,000元。
七、实验风险及安全
本任务所涉及的蛋白提取及纯化实验可能存在在操作过程中的人身伤害和危险，请实验人员谨慎操作，采取防护措施，确保实验人员安全。
八、参考文献
1.Su,Y.,Pan,W.,Zhang,W.,Yao,S.:High-yieldexpression,purification,andcharacterizationofthesolubledomainofpenicillin-bindingprotein1bfromEscherichiacoli.MicrobialCellFactories12,20(2013).
2.Park,S.,May,W.,Strynadka,N.:Structureofthereceptor-bindingdomainofthebacteriophagechiH95cSpike,bioRxiv(2012).