酶的分离和纯化.ppt

第二章酶的分离和纯化IsolationandPurificationofenzyme第一节原料选择及预处理细胞破碎第二节酶的粗提沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力

讨论：
（a）盐的加入速度合适
（b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关
（c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.1M
（d）硫铵饱和溶液pH<7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液
（e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力

此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩透析与浓缩透析技术原理图超滤技术原理图第三节酶的精制纸层薄层3）离子交换层析（ionexchangechromatography）：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离

a）阳离子交换层析b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂CM-Cellulose、CM-Sephadex
e）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型
阳离子交换剂：碱→水→酸→水→平衡
阴离子交换剂：酸→水→碱→水→平衡f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量；径∶高=1∶15；上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种——不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3ml
g）交换剂后处理：饱和NaCl→水→酸或碱→水→平衡
连续梯度洗脱离子交换层析Anionexchangechromatography4）凝胶层析（分子筛层析）（gelfiltrationchromatography）：根据分子量大小予以分离凝胶过滤层析原理图Gelfiltrationchromatography5）亲和层析（affinitychromatography）特异性结合亲和层析原理Affinitychromatography二、超离心技术利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离二、电泳（electrophoresis）技术PAGE和SDS-PAGE盘状电泳（A）和平板电泳（B）第四节提纯过程中的定量
纯化倍数=

回收率%=×100酶的提纯过程记录格式第五节酶蛋白分子量的测定渗透压法超速离心法SDS-聚丙烯酰胺电泳法SDS-PAGE的分子量标准曲线凝胶层析法凝胶过滤分子量标准曲线思考题作业