cDNA文库与EST序列分析ppt.ppt

组员任务分配目录cDNA文库构建及EST序列分析背景简介
cDNA基因文库：

某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
1.cDNA文库背景简介1.2cDNA文库的产生

由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多的方法主要是cDNA文库的筛选。
一方面cDNA文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此cDNA克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。
另一方面由于每个cDNA克隆只代表一种mRNA序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。
所以cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。
1.3.为什么要构建cDNA文库？

cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
1.4.怎么构建cDNA文库？1.5.cDNA文库构建后能干什么？

1)可保护濒危珍惜生物资源
2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针
3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究1.6.cDNA文库的优势及价值

1）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。
2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
2.EST序列分析背景简介2.1.EST序列分析的产生2.2.EST技术的作用价值目录cDNA文库的构建为什么构建cDNA文库真核生物基因结构原核生物有很大差异。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达,只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），并连接相应的原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。

mRNA的不稳定性
真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，因而对真核基因的表达和相关的mRNA研究，一般都是通过对cDNA的研究来进行。But如何构建cDNA文库mRNA的分离制备cDNA第一链的合成随机引物引导的cDNA合成

采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5‘-端序列。
优点：克服了oligo(dT)合成cDNA时缺少5‘-端序列的缺点，能更有效的反映出表达mRNA全长的序列信息。
缺点：对mRNA样品的纯度要求苛刻。
cDNA第二链的合成
www.themegallery.com方法三：PCR法cDNA的克隆cDNA文库构建的其他方法优点：可以简便cDNA合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有cDNA的丢失之忧，也无其他物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的cDNA合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量。
差示cDNA文库
差示文库又称为扣除文库，是反映不同组织和细胞或同一细胞在不同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。主要用于研究细胞的发育、分化、细胞周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病的研究。
基本流程：分别提取不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下细胞的mRNA，将其中一种细胞的mRNA反转录成cDNA第一链，然后将该cDNA与另一细胞过量的mRNA进行杂交，第一种细胞中若存在不同于第二种细胞的特殊基因，则会产生特殊基因的mRNA和cDNA，它们不能与第二种细胞的mRNA形成杂交体。将未形成杂交体的cDNA分出，合成与之互补的cDNA第二链，再以此双链cDNA构建cDNA文库，即差示文库。
标准cDNA文库
染色体或区域特异性cDNA文库
限制性cDNA文库
0ligo—capping方法构建cDNA文库
研究背景：材料：方法与步骤：总RNA提取和质量检测
三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库可以提供三疣梭子蟹病害防治理论基础。为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。1、三疣梭子蟹采自浙江海域;
2、总RNA提取Trizol试剂盒(TrizolPlusRNAPurificationKit)与mRNA分离试剂盒(FastTrack2.0Kit)购自Invitrogen公司;
3.、SMARTTMcDNALibraryConstructionKit与Adv