蛋白质浓度测定方法课件.ppt

蛋白质浓度测定方法四种古老的经典方法：
定氮法
双缩尿法（Biuret法）
Folin－酚试剂法（Lowry法）
紫外吸收法分光光度计的使用补充知识微量凯氏（Kjeldahl）定氮法以甘氨酸为例，其反应式如下：试剂
1.消化液：30%H2O2∶浓H2SO4∶H2O=3∶2∶1
2.30%NaOH溶液3.2%H3BO3溶液
4.混合催化剂（粉末K2SO4-CuSO4混合物）K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。
5.0.01mol/L标准盐酸溶液
6.混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。
7.蒸馏水
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g%）=蛋白氮×6.25双缩脲法双缩脲双缩脲反应:碱性环境试剂Folin－酚试剂法（Lowry法）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度CoomassieDye-Based蛋白质定量基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。三、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂测量后的计算方法一讨论