蛋白质浓度测定方法.doc

蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适

用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓

冲体系选择合适的测定方法。

一、考马斯亮蓝法（bradford法）－

在本实验室中主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度

测定

（一）实验原理考马斯亮蓝法（bradford法），是根据蛋白质与染料

相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白

质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜

色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别

是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值

A

595

，与蛋白质浓度成正比。/&BIe`

bradford法的突出优点是：~G_Z~|

（1）灵敏度高%w

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只

需要5分钟左右。

（3）干扰物质少。如干扰lowry法的K

+

、Na

+

、Mg

2+

离子、tris缓冲

液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。zat

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此

bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时

通常选用G—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。#

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂triton

x-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。k%{n*

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，

而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

（二）试剂与器材6

1.试剂：Q*H@::

（1）标准蛋白质溶液，用G—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制

成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮蓝G—250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G—250，

溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。

SY0;.Rg

2.器材：=A7zUjg

（1）可见光分光光度计bZ!?4

（2）旋涡混合器CV|h6-#

（3）试管16支=HB!9

（三）操作方法|O{!=r

1.标准方法（要用96孔板进行实验，方法参照pierce公司试剂盒，

此方法可以保留，但是要加96孔板实验方法）$t

（1）取13支试管，1支作空白，其余试管分为两组，分别加入样品、

水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0(空

白)、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，

立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难

于消除）。2U:X}

（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定

各样品在595nm处的光吸收值A

595

，空白对照为第1号试管，即0.1ml

H

2

O加5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂。NIS3*

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比

色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿

决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。H

（3）另取O.1mL未知浓度的蛋白溶液同上测定cL!3(In?

（4）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A

595

为纵座标，

作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的

A

595

值，即可查出未知样品的蛋白质含量。NL9V@

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A

595

约为0.50。{\?8Zk7

2.微量法xtiRuXj6R

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100ug/ml）,可将取样量（包括补

加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH

2

O,

考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定

595nm的光吸收值。RGFU[B5

0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A

595

约为0.29。W0%x

二、紫外吸收法N[1]HF1l}*

优点：

1紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

2低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH

4

）

2

SO

4

等和大多数缓冲

液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。

缺点：

1测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定

蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨