蛋白质浓度测定方法.ppt

蛋白质浓度测定方法四种古老的经典方法：
定氮法
双缩尿法（Biuret法）
Folin－酚试剂法（Lowry法）
紫外吸收法分光光度计的使用原理

光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。
当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。补充知识紫外分光光度计微量凯氏（Kjeldahl）定氮法原理以甘氨酸为例，其反应式如下：器材
1.100ml凯氏烧瓶
2.改进型凯氏定氮仪
3.50ml容量瓶
4.分析天平（电子天平）
5.烘箱6.电炉7.酒精灯
8.小玻璃珠9.滴定管
10.洗瓶
11.锥形瓶
12.铁架台
试剂
1.消化液：30%H2O2∶浓H2SO4∶H2O=3∶2∶1
2.30%NaOH溶液3.2%H3BO3溶液
4.混合催化剂（粉末K2SO4-CuSO4混合物）K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。
5.0.01mol/L标准盐酸溶液
6.混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。
7.蒸馏水
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g%）=蛋白氮×6.25双缩脲法双缩脲双缩脲反应:碱性环境
原理

双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。
在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。试剂Folin－酚试剂法（Lowry法）试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二：1NFolin--酚试剂(乙)。方法：标准曲线；试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液（500微克/毫升），加水补足1毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂（甲），摇匀，室温置放10分钟，再依次加入1N（0.5毫升）Folin----酚试剂（乙），摇匀，30摄氏度保温30分钟。然后在分光光度机上比色测定（A750）。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度CoomassieDye-Based蛋白质定量总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。三、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂四、结果处理
1.绘制标准曲线
以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品的计算
根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。
五、注意事项
1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。
2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。
3.比色杯的使用
测量后的计算方法一讨论