猪流行性腹泻病毒nsp5宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定的开题报告.docx

猪流行性腹泻病毒nsp5宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定的开题报告
一、研究背景及意义
流行性腹泻是一种常见的肠道感染疾病，其中猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是引起猪流行性腹泻的主要病原体之一，已经在全球多个地区引起了严重的经济影响。该病毒主要通过口服途径传播，临床表现为腹泻、呕吐等症状，严重时可导致幼猪死亡率高达90%以上。目前疫苗对该病毒的控制作用尚不明确，因此寻找有效的控制手段迫在眉睫。
PEDV的核酸序列已经被广泛报道，基因组大小为28kb左右，含有14个开放读码框（openreadingframes，ORFs）。其中，ORF1a和ORF1b编码的是该病毒的非结构蛋白，分别参与病毒的复制和转录过程。而ORF3、ORF4和ORF5等编码的是该病毒的外膜蛋白和核心蛋白，参与病毒的包膜和核酸复制等过程。这些病毒蛋白与宿主细胞发生作用，构成了病毒侵染和复制的关键环节。因此，寻找猪流行性腹泻病毒与宿主细胞互作的蛋白，对理解该病毒的传播机制、病因学和病理学以及预防和治疗方案的制定具有重要的意义。
二、研究内容和方法
本研究的主要目标是筛选和鉴定猪流行性腹泻病毒nsp5宿主细胞互作的蛋白。nsp5是PEDV的一个非结构蛋白，参与病毒的复制和转录等关键过程。该病毒蛋白与宿主细胞发生互作，形成病毒复制和传播的关键环节之一。因此，本研究将对nsp5宿主细胞互作的蛋白进行筛选和鉴定，以期能够揭示PEDV与宿主细胞互作的机制，为预防和治疗该病毒感染提供理论基础。
本研究采用以下方法进行筛选和鉴定猪流行性腹泻病毒nsp5宿主细胞互作蛋白：
第一步：构建nsp5的表达质粒并进行表达
使用PCR方法扩增nsp5的全长序列，并克隆至表达质粒pET-28a(+)中，构建重组蛋白表达质粒。通过大肠杆菌BL21*Gold(DE3)进行表达，利用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，得到高纯度的nsp5蛋白。
第二步：筛选nsp5与宿主细胞相互作用的蛋白
通过GSTpull-down实验，将GST-taggednsp5与宿主细胞内蛋白进行结合，并通过SDS-PAGE和Westernblotting等方法进行检测并分离。通过质谱分析技术，鉴定与nsp5相互作用的蛋白质。
第三步：鉴定nsp5与宿主细胞相互作用的机制
利用荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET）技术，揭示nsp5蛋白与宿主细胞相互作用的分子机制。同时，调整nsp5与宿主细胞内相互作用的条件，如温度、ph值、离子浓度、蛋白浓度等，探索影响两者相互作用的因素。
三、预期研究结果
通过本研究，将得到以下重要结果：
1.筛选出nsp5与宿主细胞相互作用的蛋白，并通过质谱分析技术进行鉴定；
2.揭示nsp5与宿主细胞相互作用的分子机制，并确定影响两者相互作用的因素；
3.提高对PEDV的认知，为寻找PEDV抑制剂和疫苗提供理论基础。
四、论文结构
本文主要分为以下几个部分：
1.绪论：简述PEDV和nsp5的相关知识，研究背景和意义，阐述本研究的目的和内容；
2.材料与方法：对本研究所用的材料和方法进行详细的描述和说明；
3.结果与分析：对本研究的结果进行阐述和分析，并对相关数据进行统计和绘图；
4.讨论：基于结果和分析，讨论nsp5与宿主细胞相互作用的机制及其在PEDV感染中的作用，探讨可能的应用价值和未来的研究方向；
5.结论：对本研究的结果进行总结，并提出未来研究的展望和建议。
五、参考文献
1.HouYJ,etal.ScreeningofHostCellProteinsInteractingwithPorcineEpidemicDiarrheaVirusNucleocapsidProteinbyYeastTwo-HybridSystem.VirologicaSinica.2018;33(3):224-235.
2.SunR,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp5interactswithhostprohibitinandmodulatesautophagy.VetMicrobiol.2018;217:165-173.
3.WangL,etal.PorcineEpidemicDiarrheaVirusInducesAutophagytoBenefititsReplication.Viruses.2018;10(8):428.
4.XuL,etal.IdentificationandCharacterizationofNovelPorcineEpidemicDiarrheaVirus(PEDV)VariantwithG32Ra