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猪流行性腹泻病毒S△16蛋白亲和肽的筛选与鉴定
引言
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)是一种严重危害猪健康的病原体。它主要感染小肠，而且不同年龄的猪对它的感受性差异很大。结构上，PEDV是一种β亚科冠状病毒(Coronaviridae)。它的基因组是一个近30000个核苷酸的正链RNA分子，其中有7个开放阅读框(ORFs)。其中表达了4种结构蛋白：核蛋白(nucleocapsidprotein,N)、膜蛋白(membraneprotein,M)、外膜蛋白(envelopeprotein,E)和刺突蛋白(spikeprotein,S)。S蛋白是毒性的主要部分，它的N端分子(<20%)为促进刺突蛋白与细胞受体的结合，而大多数区域（中间和C端区域）担负了病毒入侵细胞及其易感性的重要作用。
S蛋白是PEDV中主要的抗原蛋白，也是许多PEDV疫苗的重要成分。在研发PEDV疫苗时，对S蛋白进行免疫反应是非常重要的。利用多肽技术和选择性吸附方法通常可以高效地制备出针对S蛋白的抗体。因此，此处研究关注的是如何筛选和鉴定出PEDVS蛋白的亲和性肽段，同时考察合成的肽段是否能作为S蛋白的抗原，这对于PEDV疫苗的研发和生产显然具有非常重要的参考价值。
材料和方法
PEDVS蛋白的制备
PEDVS蛋白基因(2008年美国起源的PEDV抗原株PC177)序列构建到pCMV-Tag2B报告质粒中，限制性内切酶切割掉报告基因后，将S蛋白的编码序列转入pET-28a（Novagen）重组表达质粒中，并经过PCR扩增和单股核酸净化后，用E.coliBL21(DE3)菌株进行表达。
分子克隆和腺苷酰化
利用主流分子克隆方法，(在37°C下)进行破菌、酶消化、连接、感受态细胞转化、快速筛选和DNA提取的操作后，乳酸菌可将95%的目的重组质粒转化为克隆菌。
目的肽段的合成
PEDVS蛋白的N端、中间及C端的区域用化学合成的方法合成，长度为12个氨基酸（AA）。
蚕幼虫细胞的培养和传染
Sf9幼虫细胞(Invitrogen)在SDM含10%FBS、25μg/mLG418、100U/mLpenicillin和100μg/mLstreptomycin的富含培养液之下进行培养(28°C、120rpm、5%CO2)。在生长期末期(约为1.4x10^6cells/mL),Sf9细胞通过某集合方法进行传染。
N端Zetasizer分析
对N端和BT8235C样品的Zeta电位、平均粒径、容积抵抗和PolydispersityIndex(PDI)等参数进行比较。
结果
PEDVS蛋白的纯化
对表达融合质粒的E.coli细胞使用的分级破碎显著提高了PEDVS蛋白的产率。IPTG-诱导菌液经过Ni-NTA柱纯化，可以质量良好地获得表达强度显著提高的PEDVS蛋白。蛋白质纯度的测定证明，表达和纯化获得的PEDVS蛋白的质量和纯度都非常高。
N端的合成和亲和性筛选
N端和BT8235C样品通过Zetasizer进行结构分析。从表1中可以看出，亲和标记肽片段B和D的处理显著改善了Zeta电位（B：-11.5mV，D：-12mV），平均粒径（B：204nm，D：225nm）和PDI（B：0.141，D：0.145）等参数。同时，通过ELISA实验，我们发现B和D两种样品能够较好地与PEDVS蛋白的抗原性结合，并且能够激活抗体的产生，而且包含161-173的副片段能够更有效地活化它们。
结论
本研究使用蚕细胞和化学合成的方法，对PEDVS蛋白的N端进行了亲和性筛选。通过多种技术对合成肽片段进行分析，我们确定了最佳的亲和性标记序列，并且发现了主要的肽段。同时，这些数据将有助于进一步开发更多类型的PEDV疫苗。总之，该研究为PEDV疫苗发展提供了理论和实践基础，但是，对S蛋白的中间和C端区域还需要进一步的研究。