基于转录组测序大规模开发早实枳SSR标记的任务书.docx

基于转录组测序大规模开发早实枳SSR标记的任务书
一、研究背景
早实枳（ZiziphusjujubaMill.cv.‘Dongzao’）是我国重要果树之一，其具有高产、耐寒、抗逆等优良特性，在食品工业和药用领域有广泛的应用价值。然而，由于早实枳一代繁殖能力差且遗传多样性低，利用分子标记辅助育种提高早实枳品种的遗传改良程度是必要的。其中，SSR（SimpleSequenceRepeat）序列是一种基于DNA多态性的分子标记技术，已被广泛地应用于物种鉴定、种质资源评价、构建遗传图谱、进行物种间亲缘关系分析等领域。因此，开展早实枳基于转录组测序的SSR标记开发是一项非常重要的研究任务。
二、研究目的
本研究旨在通过对早实枳的转录组测序，筛选出一批潜在的SSR序列并进一步开发成SSR标记库，为早实枳品种鉴定和育种工作提供有效的分子手段。
三、研究内容与方法
1.样品采集与RNA提取
采用早实枳代码为‘Dongzao’的3岁春秋表观正常的幼果为研究材料。在采摘后，将较小植株、不规则果实以及已经呈现症状的部分剔除。从每个来源采集20个果实，分别混合成一个样本，样本名记为‘Dongzao’。RNA的提取采用三法分离方法，受检样品首先粉碎、在38度、55度和68度加入以下三种提取试剂：TRIzol提取试剂、GuSCN-LiCl提取试剂和聚山梨醇提取试剂，依次进行离心沉淀，各稀释盒可得到上清液。
2.转录组测序和基础分析
将样品送往专业机构进行转录组测序并进行基础分析，包括序列质量控制、拼接、注释、功能分类和差异表达分析等。得到的数据序列将被用于进一步的开发SSR标记。
3.SSR标记筛选
采用本地搭建的PERL脚本和MIcroSAtellite(MISA)工具，基于转录组测序数据筛选潜在的SSR序列，同时对其进行检验。筛选的条件包括：重复序列长度达到2-6bp、重复单元数量不少于8个、重复次数少于10个、读长不含太多片段插入和片段缺失等。将根据筛选出的SSR序列，在全长序列的基础上为其进行设计引物。同时，在设计过程中将坚持“重视保守性，避免不对数目”原则。
4.SSr标记PCR扩增和验证
将所有SSR引物序列进行合成，然后利用dnaSP.v5.0进行PSR扩增验证。验证结果将用于优化引物序列，并确定成功扩增的引物序列。在验证过程中，还将进行多态性验证，包括亲和性和同步性验证。
四、研究意义与预期结果
本研究通过转录组测序技术筛选出了一批早实枳的SSR序列并开发成SSR标记库。这可为早实枳品种鉴定和育种工作提供有效的分子手段。预期结果如下：
1.筛选出的SSR序列将有助于帮助我们更准确地进行早实枳品种的鉴定。
2.开发的SSR标记库可以通过遗传图谱、亲缘关系分析和基因定位等方法来研究早实枳的遗传多样性和遗传进化。
3.本研究将进一步推动早实枳的遗传改良和开发工作。
五、研究进度及费用预算
本研究预计进行1年，预期费用预算如下：
1.花费30000元完成样品采集、RNA的提取和转录组测序工作。
2.花费50000元从转录组测序数据中筛选出一批潜在的SSR序列并进一步开发成SSR标记库。
3.花费20000元进行SSR标记PCR扩增和验证研究。
6.参考文献
1.ChenS,HuangZ,DaiY,etal.(2019).DevelopmentofSSRmarkersinZiziphusjujubaMill.usingtranscriptomesequencing.BiochemicalSystematicsandEcology,82:16-21.
2.ZhangX,LiY,SongZ,etal.(2018).CharacterizationanddevelopmentofEST-SSRmarkersinZiziphusjujubaMill.MolecularBreeding,38(11):137.
3.WangP,WangJ,WangL,etal.(2017).DevelopmentofMicrosatelliteMarkersinZiziphusjujubaMill.UsingRestrictionSite-associatedDNASequencing.HortScience,52(5):746-749.