轮状病毒疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105749270A(43)申请公布日2016.07.13(21)申请号201610122156.6(22)申请日2016.03.03(71)申请人深圳康泰生物制品股份有限公司地址518000广东省深圳市南山区科技园科发路6号(72)发明人张改梅甘建辉刘建凯肖坚(74)专利代理机构深圳市盈方知识产权事务所(普通合伙)44303代理人杨贤(51)Int.Cl.A61K39/15(2006.01)A61K39/295(2006.01)A61P31/14(2006.01)C12N7/00(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图3页(54)发明名称轮状病毒疫苗及其制备方法(57)摘要本发明公开一种轮状病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：轮状病毒在MRC-5细胞上进行适应性培养，连续传10-12代；复苏MRC-5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:3-1:4进行传代培养3-4天；在培养基中加入浓度为10-15g/L的微载体，接种初始密度为0.5-2×106cells/ml的经传代培养的MRC-5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；待MRC-5细胞生长至1-3×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的血清型轮状病毒，使其感染MRC-5细胞；待CPE达到80％以上时，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。本发明还公开了相应的轮状病毒疫苗。本发明可大幅度提高轮状病毒疫苗安全性、病毒收获量和滴度，节约劳动力成本与时间成本，大大降低生产成本，高效应用于多价轮状病毒疫苗的大规模化生产中。CN105749270ACN105749270A权利要求书1/1页1.一种轮状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，轮状病毒在MRC-5细胞上进行适应性培养，连续传10-12代；步骤2，复苏MRC-5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:3-1:4进行传代培养3-4天；步骤3，在培养基中加入浓度为10-15g/L的微载体，接种初始密度为0.5-2×106cells/ml的经传代培养的MRC-5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；步骤4，待MRC-5细胞生长至1-3×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的血清型轮状病毒，使其感染MRC-5细胞；步骤5，待CPE达到80％以上，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体采用GE公司的CytodexⅠ微载体，所述生物反应器采用美国NBS公司的310型14L细胞培养生物反应器。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中，保持所述生物反应器控制参数为：pH值7.0-7.8、温度35℃-37℃、溶氧40％-60％、搅拌速率20-75rpm。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤4中，按照MOI＝0.001-0.05比例接种病毒，将搅拌速率控制在25rpm，使病毒均匀吸附于细胞表面，约1-2小时后，再将搅拌速率控制在50～75rpm。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述轮状病毒通过以下步骤进行胰酶激活：将激活剂加入病毒液中，使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70-90分钟，期间摇晃2-3次。6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中，采用连续灌流式培养。7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基成分包括BME、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和10％小牛血清。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，上述各步骤中，用Vero细胞替代所述MRC-5细胞，用M199、DMEM、碳酸氢钠和10％小牛血清代替所述培养基成分。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述轮状病毒为G1、G2、G3、G4、G9型轮状病毒中的任意至少一种。10.一种轮状病毒疫苗，其特征在于，根据权利要求1-9中任一项所述的方法制得。2CN105749270A说明书1/9页轮状病毒疫苗及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物活细胞制药领域，尤其涉及一种轮状病毒疫苗及其制备方法。背景技术[0002]轮状病毒主要感染3月龄到5岁的儿童，其感染率可达30％-65％，其中6月龄到2岁的儿童中发生中度和重度感染最多。据世界卫生组织(WHO)报告，在2008年时全球约有45.3万儿童死于轮状病毒胃肠炎(RVGE)，约占全部死亡儿童的5％，5岁以下儿童的死亡率为86/10万。其中，中国轮状病毒腹泻死亡率占全球8％。此外，我国各省、市均有报道轮状病毒爆发流行的记载。轮状病毒腹泻不仅危害人类生命健康，也对社会和家庭造成了巨大的经济损失。因此，在2009年，WHO建议所有成员国将RV疫苗纳入其儿童计划免疫程序中