人胰多肽核酸适配体及其筛选方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106282193A(43)申请公布日2017.01.04(21)申请号201610646875.8(22)申请日2016.08.08(71)申请人湖南大学地址410082湖南省长沙市河西岳麓山湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室(72)发明人羊小海覃诗雅陈南迪王青王柯敏(74)专利代理机构湖南兆弘专利事务所(普通合伙)43008代理人赵洪黄艺平(51)Int.Cl.C12N15/115(2010.01)C12N15/10(2006.01)G01N33/74(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表4页附图9页(54)发明名称人胰多肽核酸适配体及其筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种人胰多肽核酸适配体及其筛选方法和应用，人胰多肽核酸适配体为以Q10、5’-Q11-FAM-3’、5’-Q12-FAM-3’、5’-BHQ1-Q13-3’、5’-Q14-BHQ1-3’、5’-SH-Q16-3’、5’-SH-Q17-3’中的任意一种。其筛选方法包括合成随机文库和引物、GO-SELEX筛选、PCR扩增文库、制备DNA单链文库、重复筛选、阴性筛选、多轮筛选等步骤。本发明的人胰多肽核酸适配体可应用于制备检测人胰多肽的试剂盒，具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优势。CN106282193ACN106282193A权利要求书1/2页1.一种人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述人胰多肽核酸适配体为以下序列1～7中的任意一种：序列1为Q10，所述Q10的序列为SEQIDNO.1所示的序列；序列2为5’-Q11-FAM-3’，所述Q11的序列为SEQIDNO.2所示的序列；序列3为5’-Q12-FAM-3’，所述Q12的序列为SEQIDNO.3所示的序列；序列4为5’-BHQ1-Q13-3’，所述Q13的序列为SEQIDNO.4所示的序列；序列5为5’-Q14-BHQ1-3’；所述Q14的序列为SEQIDNO.5所示的序列；序列6为5’-SH-Q16-3’，所述Q15的序列为SEQIDNO.6所示的序列；序列7为5’-SH-Q17-3’，所述Q15的序列为SEQIDNO.7所示的序列。2.根据权利要求1所述的人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述序列1～7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。3.根据权利要求1所述的人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述序列1～7的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。4.根据权利要求3所述的人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述荧光物质包括荧光素、罗丹明、花青素；所述纳米材料为金纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶。5.根据权利要求1至4中任一项所述的人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述人胰多肽核酸适配体还包括以下三种序列中的任意一种：(1)与所述人胰多肽核酸适配体的核苷酸序列的同源性在80％以上；(2)与所述人胰多肽核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；(3)所述人胰多肽核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。6.根据权利要求1至4中任一项所述的人胰多肽核酸适配体，其特征在于，所述人胰多肽核酸适配体还包括所述人胰多肽核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者所述人胰多肽核酸适配体改造成的相应肽核酸。7.一种权利要求1至6中任一项所述人胰多肽核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、合成随机文库和引物：随机文库采用RS35随机文库：5’-AGCGTCGGATACCACTACTA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-ATCATGGAGTTCGTGGTCAG-3’，5’引物：5’-FAM-AGCGTCGGATACCACTACTA-3’，3’引物：5’-Biotin-CTGACCACGAACTCCATGAT-3’；S2、GO-SELEX筛选：将人胰多肽干粉溶解于缓冲溶液中，与随机序列进行孵育；然后加入含有氧化石墨烯的缓冲液进行孵育，经离心收集上清，即为人胰多肽特异核酸适配体文库；S3、PCR扩增文库：将所述人胰多肽特异核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增产物；S4、制备DNA单链文库：将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将所述扩增产物与琼脂糖微球在常温下孵育；然后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清液；将所述上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，即为DNA单链文库；S5、重复筛选：将所述DNA单链文库替代所述步骤S2中的随机文库，并重复上述步骤S2～S4的过程至少一次；2CN106282193A权利要求书2/2页S6、阴性筛选：将牛血清白