粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110669766A(43)申请公布日2020.01.10(21)申请号201910931865.2C12R1/01(2006.01)(22)申请日2019.09.29(71)申请人皖南医学院第二附属医院地址241000安徽省芜湖市康复路10号(72)发明人唐晓磊华影周发友章宏祥黄友明(74)专利代理机构北京酷爱智慧知识产权代理有限公司11514代理人袁克来(51)Int.Cl.C12N15/115(2010.01)C12N15/70(2006.01)G01N33/569(2006.01)A61K39/02(2006.01)A61P31/04(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图7页(54)发明名称粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种黏附素适配体及筛选该黏附素适配体的方法，本发明以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，扩增得到其黏附素基因，将得到的基因与表达载体连接获得筛选靶标，再将筛选靶标与随机单链ssDNA文库孵育，SELEX筛选，PCR扩增文库，然后经多轮筛选得到黏附素核酸适配体。本发明还公开了该黏附素适配体在制备幽门螺杆菌的检测试剂盒以及制备幽门螺杆菌免疫药物中的应用。本发明的黏附素核酸适配体具有较高的亲和力与特异性，分子量小、渗透性强，相对现有技术能够更直观的反应机体感染Hp的状况。CN110669766ACN110669766A权利要求书1/1页1.一种黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQIDNO.1限定的核苷酸序列同源性在60％以上、与SEQIDNO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQIDNO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。2.根据权利要求1所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。3.根据权利要求1或2所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。4.一种权利要求1所述的核酸适配体的的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(HpaA)基因；(2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coliBL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素HpaA即为筛选靶标；(3)将步骤(2)得到的黏附素HpaA与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA；(4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；(5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coliDH5α菌株；(6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与HpaA的结合力，得到核酸适配体。5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中HpaA引物序列为：F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’；R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’。6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，ssDNA文库包括序列：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’；引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。7.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯化的粘附素HpaA包被于聚苯乙烯微孔中，然后将合成的ssDNA文库溶于筛选缓冲液投入其中，洗下结合的ssDNA作为下一轮的模板；第五轮后以空白孔为负向筛选介质。8.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备检测幽门螺杆菌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。9.一种幽门螺杆菌检测试剂，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体。10.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。2CN110669766A说明书1/7页粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用技术领域[0001]本发明涉及核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测幽门螺杆菌的核酸适配体及其筛选方法和应用。背景技术[0002]核酸适配体是采用指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)从随机单链寡