基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106591293A(43)申请公布日2017.04.26(21)申请号201611238187.4(22)申请日2016.12.28(71)申请人贵州省草业研究所地址550006贵州省贵阳市金农社区金农路1号贵州省农业科学院内(72)发明人李小冬蔡璐于二汝王小利黄河斋莫本田吴佳海蔡一鸣(74)专利代理机构贵阳中新专利商标事务所52100代理人李亮程新敏(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表3页附图2页(54)发明名称基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法(57)摘要本发明提供了一种提供基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法，合成的接头引物能够互补且具有与某些酶切位点相同粘端，通过变性退火反应形成对应酶切位点的连接接头。此外本发明还公布了边酶切边连接构建目的基因侧翼序列文库的方法，通过2-3轮巢式PCR精确的分离出目的基因的侧翼序列，可以解决无基因组参照动植物获得基因组信息困难、耗时、以及精准度较差等难题，同时，该方法对待分离基因所属的物种没有选择性，其核心技术环节接头的制备有多种变化模式，且能够通过电泳等方法快速简单的鉴别假阳性，能够高效、快速、廉价的从未知基因组中分离出目标基因的序列信息。CN106591293ACN106591293A权利要求书1/1页1.一种基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)利用碱基互补配对原理人工合成引物，根据待获取侧翼序列的目标基因设计3条PCR扩增反向引物，其中3条引物的结合位点都靠近已知基因的5’端，按照离5’从远到近依次命名为R1、R2与R3；人工设计一条正向引物AF，其具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，根据SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，设计两条正向引物序列，按照离5’从近到远依次命名为命名为AD1与AD2，AD1与AD2分别具有如SEQIDNO：7与SEQIDNO：8所述的核苷酸序列；AD1与R1进行第一轮PCR扩增，AD2与R2进行第二轮PCR扩增，AD2与R3进行第3轮PCR扩增，第1轮PCR产物片段最长，第3轮最短；第2轮PCR引物的结合位点在第1轮PCR产物上，但在第1轮引物的结合位点内部或与第1轮引物结合位点有部分重叠；同样，第3对引物结合位点在第2轮PCR产物上，但在第2轮引物的结合位点内部或与第2轮引物结合位点有部分重叠，该3轮PCR产物每轮之间均相差50-100bp；2)人工设计引物序列AER，AHR，ABR，AXR，APR，它们分别具有如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5，SEQIDNO：6所示的核酸序列，将上述引物分别与SEQIDNO：1所示的引物序列通过变性退火反应依次生成与EcoRⅠ、BamHⅠ/BglⅡ、HindⅢ、XhoⅠ、SmaⅠ/EcoRⅤ具有相同粘性末端的接头，该接头能与对应的酶切产物的粘端互补，在连接酶作用下能够完成连接反应，通过人为设计粘端之外的碱基使连接反应完成后原来的酶切位点消失；3)利用步骤2)所述的一种或几种限制性内切酶分别消化目标物种的基因组，分别对应加入步骤2)所准备好的接头与连接酶，在2-16℃条件下边酶切边连接，反应产物作为侧翼序列分离第1轮PCR的模板；4)将步骤3)中获得的模板稀释5-10倍进行第1轮PCR扩增，以第1轮扩增的产物稀释10-200倍为模板进行第2轮扩增，以第2轮产物稀释10-100倍为模板进行第3轮扩增，并分别进行电泳检测，在第2轮与第3轮间可见两条相差50-100bp的条带；5)通过切胶回收目的条带，并进行测序分析获得目的基因的侧翼序列信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：接头制备在PCR仪中进行，采用梯度变性退火方法制备，体系如下：AF10μmol10μl，A*R10μmol10μl；A*R指5条反向引物中的一条，混合均匀进行接头制备反应，反应程序如下：94℃3min，70℃10min，60℃10min，50℃10min，30℃10min，25℃10min，结束。2CN106591293A说明书1/10页基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法技术领域[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其是从未知基因组中根据一段已知基因序列分离其侧翼序列的方法。背景技术[0002]随着现代生物技术的发展，动植物育种研究已经由传统的经验选育进入分子育种时代，分子标记被广泛用于物种进化分析，品种指纹图谱构建与差异分析以及分子育种等多个方面，然而无论是传统的SSR标记或者是功能性分子标记或者是用于做GWAS分析的高密度SNP标记都需要对应物种的的序列