轮状病毒‑霍乱联合疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107080840A(43)申请公布日2017.08.22(21)申请号201710258939.1A61P31/14(2006.01)(22)申请日2017.04.19A61P31/04(2006.01)C12N15/62(2006.01)(71)申请人武汉博沃生物科技有限公司C12N15/70(2006.01)地址430075湖北省武汉市东湖高新区高C07K19/00(2006.01)新大道858号生物医药产业园中小企业园A9-2栋(72)发明人史晋马涛李津王文灏(74)专利代理机构上海精晟知识产权代理有限公司31253代理人熊娴冯子玲(51)Int.Cl.A61K39/295(2006.01)A61K39/106(2006.01)A61K39/15(2006.01)A61K47/26(2006.01)权利要求书1页说明书18页序列表4页附图2页(54)发明名称轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法，所述疫苗包括：a.霍乱疫苗，包括霍乱弧菌肠毒素蛋白(CT)及联合蛋白佐剂，其中联合蛋白佐剂通过基因重组构建在霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白一端，霍乱弧菌肠毒素A亚单位蛋白与霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白通过连接片段相连，形成重组CT全蛋白作为抗原；及b.轮状病毒疫苗。本发明轮状病毒-霍乱联合疫苗采用重组的蛋白亚单位作为载体，连接同源的毒性蛋白亚单位，重组后的蛋白不仅具有良好的载体功能，可以是毒力亚单位更好更快的进入接种者细胞内，引发免疫反应，同时重组后的蛋白载体还具有良好的佐剂效力，可以刺激机体产生黏膜免疫反应，提高疫苗接种者对于抗原的抵抗能力。CN107080840ACN107080840A权利要求书1/1页1.一种轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：所述疫苗包括：a.霍乱疫苗，包括霍乱弧菌肠毒素蛋白(CT)及联合蛋白佐剂，其中联合蛋白佐剂通过基因重组构建在霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白一端，霍乱弧菌肠毒素A亚单位蛋白与霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白通过连接片段相连，形成重组CT全蛋白作为抗原；及b.轮状病毒疫苗。2.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：联合蛋白佐剂为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白(LTB)。3.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于，重组CT全蛋白为重组CT-LTB蛋白，构建的LTB-CTB核酸序列如序列表SEQIDNO：5所示，编码的载体蛋白序列如序列表SEQIDNO：6所示。4.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：编码LTB蛋白的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。5.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于，编码CT蛋白的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：4所示。6.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：轮状病毒-霍乱联合疫苗为喷雾剂型、液体剂型、胶囊剂型、冻干粉剂、片剂和丸剂中的任何一种。7.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：轮状病毒-霍乱联合疫苗还包括蔗糖，用于作为霍乱抗原的冻干制剂的冻干保护剂。8.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤包括：s1：根据CT和LTB的CDS区核酸序列，设计两对引物，构建pET28a-CT-LTB质粒，PCR扩增后，通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，凝胶回收CT-LTB片段和表达载体pET28a；s2.连接转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆后进行单克隆扩增，IPTG诱导后鉴定。2CN107080840A说明书1/18页轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]一、病原微生物与疫苗[0003]能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面还取决于机体的抵抗力即免疫力。病原性细菌引起传染的能力大小，就是细菌的毒力或致病性。细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。[0004]细菌产生的毒素可分为外毒素和内毒素两大类。外毒素是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。