第五章-目的基因的获取ppt课件.ppt

第五章目的基因的获取第一节基因组DNA片段化由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。二、随机片段化1）4bp的内切酶2.机械切割法1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。①保护dNTP的3’端P和5’端–OH②带保护的单核苷酸连接③用酸或碱的脱保护（2）合成过程原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。固相磷酸三酯合成过程目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用。3、亚磷酸三酯法(3)缩合反应在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。三价如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上洗脱下来，最后除去NH4OH，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。化学合成的DNA片段一般在200bp以内。T4DNA连接酶2.互补延伸连接法1.直接合成基因DNA合成仪将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。（2）目前常用的载体断点完全随机，片段长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（2）载体与基因组DNA大片段的连接各种酶的接头可以向公司定做或购买。4.基因组文库的大小1.cDNA（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA文库小的多，容易构建。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。反转录酶用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。④去掉发卡结构这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片段。在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。6.cDNA文库的大小三、文库的查询（screening）第四节目的基因的分离和扩增纤
维
柱2.mRNA消解杂交A3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）（2）12种锚定引物（3）5’端的随机引物（4）随机引物与锚定引物成对扩增（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较二、PCR技术获得目的基因（1）提取基因组totalRNA(二)未知目的基因序列(2)盒式PCR原理(3)RACE技术3`-RACE原理5`-RACE原理高特异性的5’-RACE原理三、转座子标签法目的基因标签法非目的基因标签法转座子探针四、图位克隆法1、染色体步移2、染色体登陆第五节酵母双杂交系统有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质2.拆开Domain3.重组Domain上游激活序列（UAS）上游激活序列（UAS）双杂交原理三、构建双杂交体系的宿主菌1.穿梭质粒（shuttleplasmid）靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。（2）AD-plasmid六、酵母双杂交的实验过程（1）存活选择在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。第五章作业

1、什么是基因组文库(genomiclibrary)?构建基因组文库，涉及哪些基
本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?
2、构建cDNA文库时需要用到哪些工具酶？
3、什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?化学合成DNA将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。cDNA文库2.mRNA消解杂交AmRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）转座子标签法2、染色体登陆