一种三联灭活疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108114278A(43)申请公布日2018.06.05(21)申请号201711478819.9(22)申请日2017.12.29(71)申请人湖南中岸生物药业有限公司地址410000湖南省长沙市经济技术开发区盼盼路7号(72)发明人巢伟喻正军黄岚芬(74)专利代理机构北京风雅颂专利代理有限公司11403代理人马骁于洁(51)Int.Cl.A61K39/295(2006.01)A61K39/215(2006.01)A61K39/225(2006.01)A61K39/15(2006.01)A61P31/14(2006.01)权利要求书1页说明书9页(54)发明名称一种三联灭活疫苗及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种三联灭活疫苗及其制备方法。具体包括以下步骤：对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化；生物反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞；分别接种猪轮状病毒生产种毒、猪流行性腹泻生产种毒、猪传染性胃肠炎生产种毒；收获病毒液，分别检测三种病毒效价均合格后，配制成疫苗。本发明利用生物反应器微载体悬浮培养的方式同时培养三种动物细胞、同时接种三种病毒、制备了三联灭活疫苗，大大提高了生产效率，节约了能耗；本发明方案制备的三联灭活疫苗对猪仔有较长的免疫期限，相比较于三种疫苗单独免疫，对母猪保护率和仔猪被动免疫保护率明显提高，能够大大降低猪病毒性腹泻病的比例。CN108114278ACN108114278A权利要求书1/1页1.一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化；b.生物反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞；c.分别接种猪轮状病毒生产种毒、猪流行性腹泻病毒生产种毒、猪传染性胃肠炎病毒生产种毒；d.收获病毒液，分别检测三种病毒效价均合格后，配制成疫苗。2.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤a对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化包括采用连续适应方法--在动物细胞培养猪流行性腹泻或轮状病毒的过程中逐步降低胰酶的添加量，直到病毒适应在不含胰酶的环境中繁殖为止。3.根据权利要求1或2所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤a中连续适应性方法还包括：先将胰酶添加量减少50％，再将胰酶添加量减少25％，后按照1.0μg/mL的梯度进行递减，直到病毒不再依赖胰酶进行繁殖为止，挑选出不依赖胰酶的猪流行性腹泻和猪轮状病毒生产种毒。4.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤b中反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞包括分别以不同的浓度梯度对三种动物细胞进行微载体悬浮培养，通过排列组合试验，筛选出三个毒株接种时对应的细胞密度最高的浓度组合。5.根据权利要求1或4所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤b中生物反应器微载体悬浮培养三种细胞的最佳浓度范围分别为：Vero细胞80～120万/mL、ST细胞80～120万/mL、Marc145细胞130～170万/mL。6.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤c对三种病毒生产种毒进行接种包括在细胞培养48h后接种猪轮状病毒生产种毒、细胞培养72h后接种猪流行性腹泻病毒生产种毒、细胞培养96h后接种猪传染性胃肠炎病毒生产种毒进行繁殖。7.根据权利要求1或7所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤c对三种病毒生产种毒进行接种还包括：猪轮状病毒生产种毒的接种量为0.3～1.5％，猪流行性腹泻病毒生产种毒的接种量为1.0～5.0％，猪传染性胃肠炎病毒生产种毒的接种量为0.1～1.0％。8.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤d中当细胞整体病变达到75％时收获病毒液；当猪流行性腹泻部分效价为每毫升猪流行性腹泻病毒含8.5量≧10TCID50，猪传染性胃肠炎部分效价为每毫升猪传染性胃肠炎病毒含量≧9.08.510TCID50，猪轮状病毒部分效价为每毫升猪轮状病毒含量≧10TCID50时方判定为合格。9.一种根据权利要求1～8方法制备的三联灭活疫苗。2CN108114278A说明书1/9页一种三联灭活疫苗及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物制药领域，特别是指一种三联灭活疫苗及其制备方法。背景技术[0002]猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)和猪轮状病毒(RV)腹泻是危害养猪生产的三个主要病毒性腹泻病，导致仔猪高死亡率、所有猪水样腹泻，用任何抗生素和中西药药物治疗均无效。目前临床上很难区分这三种病，而且有时呈混