传代细胞源ND、IB、AI三联灭活疫苗的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108261543A(43)申请公布日2018.07.10(21)申请号201810128488.4(51)Int.Cl.(22)申请日2018.02.08A61K39/17(2006.01)A61K39/215(2006.01)(71)申请人华农（肇庆）生物产业技术研究院有A61K39/145(2006.01)限公司C12N7/00(2006.01)地址526238广东省肇庆市高新区技术产A61P31/14(2006.01)业开发区创业路5号A61P31/16(2006.01)申请人华南农业大学C12R1/09(2006.01)肇庆大华农生物药品有限公司甘肃健顺生物科技有限公司(72)发明人陈瑞爱罗顺李延鹏温良海蔡仕君张晓楠罗琼(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202代理人肖宇扬付静权利要求书2页说明书6页(54)发明名称传代细胞源ND、IB、AI三联灭活疫苗的制备方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，包括步骤如下：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，用于病毒接种；采用二阶培养法，向EB66细胞接种新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或禽流感病毒；在接毒24h后，病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到病毒液；重复上述步骤以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液并灭活；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，制备灭活疫苗。本发明采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，提高病毒的生产品质，简化病毒的生产工艺。CN108261543ACN108261543A权利要求书1/2页1.一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，其特征在于，所述灭活疫苗的制备方法包括步骤如下：步骤1：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，当EB66细胞密度达到6×106cells/mL-15×106cells/mL时，用于病毒的接种；所述EB66细胞的培养温度为35℃-37℃，培养转速为130rpm-150rpm；步骤2：采用二阶培养法，向EB66细胞接种传染性支气管炎病毒、新城疫病毒或禽流感病毒，所述病毒的接毒量为0.0001MOI-1MOI，细胞接毒后33℃-35℃的培养温度下以110rpm-140rpm的培养转速进行吸附，吸附0.5h-2h；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的病毒液；步骤4：重复步骤1-3以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液，将收获的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液分别进行灭活；步骤5：将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，并制备灭活疫苗。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所用EB66细胞培养方法如下：从液氮中取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，至所得的EB66细胞系中细胞数量满足生物反应器的接种量。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中EB66细胞于生物反应器中进行生长培养方法如下：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养；所述EB66细胞的培养温度为37℃；培养转速为150rpm。当EB66细胞密度达到8×106cells/mL～10×106cells/mL用于病毒的接种。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液的灭活方法如下：将病毒液于灭活罐中，在搅拌的条件下加入甲醛溶液，至甲醛溶液的最终浓度为0.1％，使甲醛溶液与病毒液充分混合。在37℃的条件下保持搅拌，灭活30小时，完成病毒液的灭活。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中病毒液灭活后置2～8℃下保存。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中病毒在接种吸附完成后，还需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-4倍。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中接种病毒为禽流感病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积