一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108524927A(43)申请公布日2018.09.14(21)申请号201810472063.5A61P31/14(2006.01)(22)申请日2018.05.17A61P7/04(2006.01)C12N7/06(2006.01)(71)申请人广州普麟生物制品有限公司C12N7/00(2006.01)地址510380广东省广州市荔湾区兴渔路1号申请人中国水产科学研究院珠江水产研究所(72)发明人赵长臣江小燕陈总会刘春花张悠黄志斌巩华罗霞桑朝炯(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.A61K39/15(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法(57)摘要本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种草鱼出血病灭活疫苗，包括由含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，本发明还提供该草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，将草鱼出血症毒株GCHV-892经复苏增殖后接种于经草鱼吻端成纤维细胞(PSF)，制备成制苗用病毒液，然后灭活并稀释，加入蜂胶佐剂配置成草鱼出血症灭活疫苗。本发明制备的草鱼出血症灭活疫苗质量稳定、安全，且免疫效率高。CN108524927ACN108524927A权利要求书1/2页1.一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，由灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，所述灭活病毒液为含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。2.根据权利要求1所述的一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，所述草鱼出血症灭活疫苗中蜂胶含量为10mg/mL。3.权利要求1或2中所述草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将蜂胶佐剂加入草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液中，边加边震摇，使蜂胶与灭活病毒液充分混合成灭活疫苗，最终蜂胶含量为10mg/mL。4.根据权利要求3所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液的制备方法包括以下步骤：(1)草鱼吻端成纤维种子细胞培养：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用容量为250ml的细胞培养瓶，加入细胞培养液静止培养，细胞浓度为1×105～2×105个细胞/ml，细胞培养温度为28±1℃，培养3～4天即可长成致密单层；(2)制苗用细胞制备：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用15L大细胞瓶增殖传代，加入细胞培养液，细胞接种浓度为1.5×105～2.0×105个细胞/ml，将15L大细胞瓶置于转瓶机上旋转培养，转速12转/小时，28℃下2～3天长成单层细胞；(3)生产用毒种制备：将步骤(1)中的长成单层致密细胞的细胞培养瓶倒掉细胞培养液，按病毒:细胞＝1:100的质量浓度接种冻干GCHV-892毒种，置28℃恒温吸附1小时后，倒掉病毒液，加入细胞维持液，置28℃恒温培养，培养5～6天，细胞病变程度达75％以上，每毫8.7升病毒毒价≥10TCID50时，即得到细胞病毒培养液，保存于-70℃备用；(4)制苗用病毒液的制备：按步骤(2)的方法培养草鱼吻端成纤维细胞，待其长成单层后，倒掉细胞培养液，换以步骤(3)中制备得到的细胞病毒培养液和细胞维持液，细胞病毒培养液与细胞维持液的体积比为1：50，置于28±1℃下恒温培养，培养5～6天后，当病变细8.7胞达75％以上，每毫升病毒毒价≥10TCID50时，即可收获制苗用病毒液，置于-20℃保存；(5)灭活及稀释：将步骤(3)所得制苗用病毒液冻融混合，加入体积比为0.1％的甲醛，置35℃恒温72小时灭活病毒，用0.65wt.％灭菌生理盐水稀释100倍，制备得到草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。5.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入10wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.0～7.2。6.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞维持液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入2wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.2～7.5。7.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞消化液由胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合配制而成：用无钙镁磷酸缓冲液配制胰蛋白酶和乙