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Nanog基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备的中期报告 本项目旨在探究Nanog基因在原核表达中的功能及蛋白质结构特征,为其后续在细胞和动物实验中的应用打下基础。以下是本项目的中期报告: 一、实验进展: 1.原核表达: 首先,我们利用PCR扩增得到了Nanog基因的编码序列,并使用基因克隆技术将其克隆到表达载体pET28a中。之后,我们利用大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态菌株进行原核表达。 2.蛋白纯化: 通过紫外可见光谱测定,我们发现Nanog蛋白在感受态菌株中成功表达,但是出现了大量的包涵体。因此,我们采用了Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,并将其加入到含有0.02MTris-HCl,0.15MNaCl,pH7.5的缓冲液中进行纯化。 3.抗体制备: 我们随机选择了3只小鼠,将纯化后的Nanog蛋白注射到小鼠体内以制备抗体。目前,已经取得了小鼠血清并对其进行了初步的酶联免疫吸附实验(ELISA)检测。 二、存在的问题: 1.过量的包涵体: 我们发现大量的包涵体会干扰Nanog蛋白的表达和纯化,导致获得的蛋白质并不纯净。因此,我们需要对表达和纯化条件进行优化,以减少包涵体的产生。 2.抗体的特异性: 目前,我们还没有对制备的抗体进行进一步的验证。为了确保抗体的特异性和有效性,我们需要进行Westernblotting和免疫组化等实验,以检测抗体与其特定抗原结合的能力。 三、下一步计划: 1.优化表达和纯化条件以获得更高纯度的Nanog蛋白。 2.进行Westernblotting和免疫组化实验,以验证制备的抗体的特异性和有效性。 3.利用X射线晶体学等方法对Nanog蛋白的结构进行进一步探究,以为后续的细胞和动物实验打下基础。