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南丰蜜橘β胡萝卜素羟化酶cDNA原核表达载体构建的中期报告
南丰蜜橘β胡萝卜素羟化酶（CrtZ）是一种重要的酶类，能够催化β-胡萝卜素的羟化反应，参与维生素A的合成途径。为了进一步研究该酶的功能，我们构建了一个原核表达载体，并进行了中期实验。
1.cDNA克隆
我们从南丰蜜橘的果实中提取了总RNA，用反转录酶逆转录为cDNA。利用PCR扩增得到完整的CrtZ基因的cDNA片段，长度为1053bp。该片段的ATG起始密码子和TAA终止密码子分别位于片段的起始和终止位置。我们通过测序验证了cDNA序列的准确性，并将其插入到原核表达载体的多克隆位点中。
2.载体构建
我们选用pET-28a(+)载体作为表达载体，该载体带有His标签，便于后续的蛋白纯化。由于CrtZ是一种氧化酶，需要在表达过程中加入较高浓度的NADPH和FAD等辅因子，所以我们在载体中加入了T7启动子、LacI抑制子、kanR耐药基因和NADPH和FAD的合成基因。
3.表达实验
我们通过转化大肠杆菌Bl21(DE3)细胞获得了重组菌株。在诱导表达条件下，重组菌株显著表达了His-CrtZ蛋白。我们用SDS-PAGE、WesternBlot等方法验证了重组蛋白的表达，发现其分子量与预期一致。
目前，我们正在进行蛋白纯化及结构分析等后续实验。