cDNA文库合成.doc

基因文库之cDNA文库
——概念、原理及相关内容

提纲：
基本概念

构建的原理基本步骤构建的应用

一、基本概念
cDNA文库是指包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录形成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式储存着该组织细胞的基因表达信息。

二、构建的原理

即寡聚脱氧胸苷酸…TTTTT

cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，由mRNA合成cDNA,并给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

三、基本步骤
1、mRNA的分离2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA与载体的连接5、噬菌体包装及转染或质粒转化6、筛选阳性重组体

1、mRNA的分离

mRNA来自DNA外显子转录

流程示意：
研磨组织细胞研磨液总RNARNA提取试剂盒RNA

oligo(dT)

oligo(dT)纤维素柱

总RNA（tRNA、mRNA等）RNA（tRNA、mRNARNA

洗脱纯mRNA

注意事项：
由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换。

2、cDNA第一链的合成
合成cDNA第一链的方法是用依赖RNA的DNA聚合酶(即逆转录酶)来催化反应。cDNA第一链的合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3’端poly(A)结合的oligo(dT)（寡聚脱氧胸苷酸）。
Tips:
Primer:引物Reversetranscriptase：逆转录酶Hybrid：杂交体

3、cDNA第二链的合成
自身引导法：此法合成的单链cDNA3‘端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物，水解RNA后即可用逆转录酶合成cDNA第二链。

Tips：：
Hairpinloop:发夹结构Nuclease:核酸酶Doublestranded:双链

4、cDNA与载体的连接
已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴。
双链cDNA连接人工接头末端转移酶处理
AAA……TTT

限制性酶切载体

连接载体

5、噬菌体包装及转染或质粒转化
cDNA

溶源菌生长

溶菌生长

噬菌体包装及转染

质粒转化入感受态细胞

6、筛选阳性重组体

原位杂交OrSouthern印迹挑取阳性克隆，获得目的基因

四、构建的应用
优点：cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。应用：通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

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