cDNA文库构建.ppt

cDNA文库的构建主要内容一、基因文库的概念及意义基因文库与基因库（genebank）区别

基因文库与基因克隆构建基因文库的意义根据基因类型（重组DNA片段的供体）基因组文库和cDNA文库
1、基因组文库构建流程基因文库基因组DNA文库特点及应用：
包含所有遗传信息
构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）
筛选难度大
用于研究基因在基因组中的情况基因组物理图谱的构建
基因组序列分析
基因在染色体上的定位
克隆鉴定基因调控元件
基因组中基因的结构和组织形式分析结构基因cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库cDNA文库的构建：自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以来，构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期cDNA文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而YOUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，cDNA文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。cDNA文库优点注意3、cDNA文库和基因组文库的区别两种文库均有应用，如何选择
根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。亚克隆文库二、cDNA基因文库的类型（一）非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库（二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库（2）表达文库由表达载体构建，载体除具有克隆载体的元件外，还具有控制基因表达的序列，如启动子、SD序列、ATG、终止子等，可在宿主细胞内表达出克隆片段的编码序列，它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。
分离基因时，由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗原性和生物活性，所以除核酸探针外，还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。
表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因分离。（三）不同载体文库构建文库的载体置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“填充片段”gam和red基因座丢失引起的。
供体DNA的大小：
插入载体：0-10kbp;
置换载体：9-23kbp。
插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。
主要应用：
插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。
置换载体:基因组DNA克隆。
2.粘粒(cosmid)载体
基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒；
导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞；
载体筛选：类似于质粒
重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选；
供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。
主要应用：基因组文库构建。

3.质粒载体构建cDNA文库4.大容量克隆载体(1)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)
基础：大肠杆菌F质粒
导入宿主：电转化
载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。

(2)P1载体和P1人工染色体(P1artificialchromosomes,PACs)
基础：噬菌体P1
导入宿主：体外包装和转导
载体筛选：显性选择标记
重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选
供体DNA大小：约100kbp
主要应用：大基因组分析
评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。
(3)酵母人工染色体(yeastartifici