猫血清淀粉样蛋白A及其单克隆抗体的制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109517050A(43)申请公布日2019.03.26(21)申请号201811384920.2C12R1/19(2006.01)(22)申请日2018.11.20(71)申请人杭州贤至生物科技有限公司地址311100浙江省杭州市余杭区东湖街道东湖北路488-1号16幢401室(72)发明人刘清泉胡祥叶朱伟项美华武戌青王立童吴琼杉余铭恩(74)专利代理机构北京天奇智新知识产权代理有限公司11340代理人朱海江(51)Int.Cl.C07K14/47(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C07K16/18(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页(54)发明名称猫血清淀粉样蛋白A及其单克隆抗体的制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一种重组蛋白，该重组蛋白包含猫血清淀粉样蛋白A的两个优势抗原表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记铕离子(Eu3+)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于猫感染性炎症的早期诊断。CN109517050ACN109517050A权利要求书1/1页1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有如序列表SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。2.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白包含如序列表SEQIDNo:2和SEQIDNo:3所示的氨基酸序列。3.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQIDNo:4所示，可编码权利要求1-2所述的重组蛋白。4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。5.一种采用权利要求4所述质粒载体转化的菌株。6.根据权利要求1-2所述的重组蛋白，其特征在于可用于猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备，包括：(a)合成权利要求3所述的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组猫血清淀粉样蛋白A表达载体；(b)将步骤(a)中的重组猫血清淀粉样蛋白A表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组猫血清淀粉样蛋白A表达菌株；(c)大规模培养重组猫血清淀粉样蛋白A表达菌株后，经纯化获取重组猫血清淀粉样蛋白A；(d)重组猫血清淀粉样蛋白A多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株；(e)纯化单抗并分别标记铕离子(Eu3+)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合。2CN109517050A说明书1/5页猫血清淀粉样蛋白A及其单克隆抗体的制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的重组蛋白，通过基因工程技术编码合成该重组蛋白的核苷酸序列，构建含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的大肠杆菌菌株，表达重组猫血清淀粉样蛋白A；使用上述重组蛋白制备猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，并应用于猫感染性疾病早期炎症的诊断。背景技术[0002]感染性疾病由细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体引起，是常见病、多发病，严重威胁机体健康，因此寻找利于早期诊疗的感染性标志物具有重要意义。血清淀粉样蛋白A(SAA)是存在于许多物种中的一种主要的急相蛋白，包括人、犬、猫和马。一旦机体受到感染、创伤及外科手术等引起的炎症刺激后，SAA浓度水平会在数小时内迅速升高。由于SAA半衰期非常短，随着炎症源的清除，SAA的浓度水平又会迅速下降。国内外已有研究表明，在细菌、病毒感染、急性炎症、慢性炎症急性发作等急性时相反应性疾病中均可检测到血清SAA升高。与传统感染标志物CRP和WBC相比，其优势在于病毒感染时也明显升高，且改变高于传统指标。鉴于其以上特性，SAA可作为敏感的感染性疾病标志物用于诊疗，成为继WBC和CRP之后，感染性疾病早期辅助诊断的又一个新指标。因此，在猫感染性疾病炎症诊断中，测定猫血清淀粉样蛋白A(fSAA)可用于诊断亚临床炎症、监控猫炎症和感染的治疗效果。[0003]目前，市场上关于猫感染性疾病早期炎症的诊断主要是对猫血液细胞进行检测分析，如测WBC(白细胞总数)、GR(中性粒细胞数)等，该方法操作繁琐而且成本高，不适合快速诊断，易耽误治疗。[0004]以免疫学为基础的血清学检测，操作简便，结果判定简单，是目前的主流方向。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度可达10-12g/mL，其利用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异荧光干扰，极大提高了分析灵