一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109762934A(43)申请公布日2019.05.17(21)申请号201910071662.0(22)申请日2019.01.25(71)申请人长江大学地址434023湖北省荆州市荆州区南环路1号(72)发明人刘国平同珂刘艳珍常小云胡利群李文静(74)专利代理机构武汉河山金堂专利事务所(普通合伙)42212代理人胡清堂(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6848(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法(57)摘要本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法，所述巢式PCR引物是通过编码猪圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因部分更保守的碱基序列，设计两对巢式检测引物。所述检测方法为：提取待测样品DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两轮PCR扩增，每轮PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测圆环病毒3型ORF2基因的特异性片段。该方法克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且成本较低，检测周期短，具有良好的应用前景。CN109762934ACN109762934A权利要求书1/1页1.用于检测猪圆环病毒3型的巢氏PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因的高度保守的碱基序列设计两对引物，所述引物为一对外侧引物PCV3-O-F、PCV3-O-R和一对内侧引物PCV3-I-F、PCV3-I-R，其序列为：PCV3-O-F：5’-GTGTGAGTGGATATACCGGGCAGTG-3’(SEQIDNO.1)；PCV3-O-R：5’-ACCCACCCACCCAATAAATAC-3’(SEQIDNO.2)；PCV3-I-F：5’-GTGTTTTGATGCCGCAGGAC-3’(SEQIDNO.3)；PCV3-I-R：5’-AAGGCCTCCAACTTTCCACGAAT-3’(SEQIDNO.4)。2.一种猪圆环病毒3型巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的两对引物、阳性对照和阴性对照，所述阴性对照为RNase-freewater，所述阳性对照为含有猪圆环病毒3型1091bp基因片段的重组质粒。3.一种用于检测猪圆环病毒3型的通用型巢氏PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、从待检测样品提取DNA；S2、以S1提取的DNA为模板，用权利要求1所述外侧引物进行第一轮PCR扩增，产物进行电泳检测，若无1091bp条带则进行第二轮扩增；S3、以第一轮扩增产物为模板，用权利要求1所述内侧引物进行第二轮扩增，产物用进行电泳检测。4.根据权利要求3所述的用于检测猪圆环病毒3型的通用型巢氏PCR检测方法，其特征在于，S1所述待测样品包括猪的血清、脾脏或肺脏。5.根据权利要求3所述的用于检测猪圆环病毒3型的通用型巢氏PCR检测方法，其特征在于，S2所述PCR反应体系总体积25μL，其中TaqMix12.5μL，PCV3-O-F、PCV3-O-R各1μL，模板1μL，ddH2O余量；反应条件为95℃预变性5min，95℃30s，60℃45s，72℃1min，共32个循环，最后72℃延伸8min。6.根据权利要求3所述的用于检测猪圆环病毒3型的通用型巢氏PCR检测方法，其特征在于，S3所述PCR反应体系总体积25μL，其中TaqMix12.5μL，PCV3-I-F、PCV3-I-R各1μL，模板1μL，ddH2O余量；反应条件为95℃预变性5min，95℃30s，62℃45s，72℃1min，共32个循环，最后72℃延伸8min。2CN109762934A说明书1/5页一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法技术领域[0001]本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法。技术背景[0002]圆环病毒(PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，该病毒为单股环状DNA病毒，无囊膜，其粒子直径为14-17nm，基因组大小约为1.76kd。PCV根据血清型分为PCV1,PCV2和PCV3。其中，PCV1在猪群中广泛存在，但无致病性。PCV2主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3，PCV3)。PCV3于2016年首次在美国报道，与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关。PCV3基因组2000bp，与PCV1