乳酸菌的分离纯化.doc

1、分离培养基采用MRS培养基,分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;
采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离,挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落,菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。

2、MRS固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MnSO4·4H2O0.25g，MgSO4·7H2O0.58g，葡萄糖20g，吐温801mL，琼脂25g，水1000mL。调pH6.2～6.4，1%CaCO3，121℃灭菌15min。
改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1%CaCO3。
10倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS培养基平板上，37℃静置培养48h。
挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种

3、MRS固体培养基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母提取物5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温-801mL,MgSO4#7H2O0.5g,MnSO40.25g,琼脂25g，蒸馏水1000mL,pH6.2~6.4,3%的CaCO3,121℃灭菌20min。
稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30℃培养24h
30℃培养24h,在MRS+3%CaCO3固体培养基上形成明显的透明圈,表面
光滑湿润。
4

5、培养基MRS液体培养基(pH5.0),富集培养用;改良MRS固体培养基(pH6.8):在培养基成分中,加入2%的CaCO3
菌种分离方法先在MRS(pH5.0)液体培养基中进行富集培养,18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。
改良TJA培养基双层琼脂培养法

乳酸菌的分离纯化
分离
（1）配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。
BCG牛乳培养基配制
A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）,121℃湿热灭菌20min。
B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。
以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。
（2）样品的处理
按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样，放入装有90ml无菌水的三角瓶内，振摇混匀。
（3）分离方法
①倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。
②十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。
③分离
直接用接种环蘸取10-3,10-4、两个稀释度的试管中原液，在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。