乳酸菌的分离纯化与鉴定.pdf

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材：1、实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%|甲酚绿乙醇溶液（漠甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、950醇、沙黄）、75%^®、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸钙；0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g;2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿_（杆或412）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。二、实验步骤：1、培养基配制（BCG牛乳培养基）:（A）溶液：取脱脂乳粉100g水500ml加入1、6咖甲酚氯乙醇溶液1ml混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80C灭菌20min;（1、6璇甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1、6g漠甲酚绿加入20ml无水乙醇中再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g水500mlCaCO310g琼脂20g加热溶解用精密pH试纸调节pH到6、8分装入三角瓶后在103kPa121C高压蒸汽灭菌20Min。以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。2、药品配制2、1结晶紫：结晶紫乙醇饱与液（结晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀放置24小时后过滤即可。2、2卢哥氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸僻水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸僻水中然后加入碘使之完全溶解再加入蒸僻水300ml即成。2、3蕃红溶液：番红2、5g95%乙醇100ml溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸僧水混匀即可。2、40、1%勺吕氏美蓝染液:A液：美蓝0、3g95%乙醇300ml;B液：0、01%KOH100ml。混合A与B液即成按1：100稀释即可。2、4生理盐水：称取9g氯化钠溶解在少量蒸僻水中稀释到1000毫升。3、菌悬液的配制取1洁净三角瓶盛以225ml生理盐水;7只洁净试管各盛9ml的生理盐水;加塞包扎于在103kPa121C高压蒸汽灭菌20Min得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中在旋涡均匀器上充分振摇使样品均匀分散即为10-1的样品稀释液；将7只装9ml生理盐水的无菌试管依次标记10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7再用无菌移液管吸10-1的菌悬:液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中稀释混匀便得到10-2稀释液如此重复依次制得10-3〜10-7的稀释液。4、倒平板取无菌平板12个编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消蠹的培养基冷却到50C左右按无菌操作法倒12只平板每皿•约15ml;平置使培养基均匀分布在皿•底待凝固。5、分离方法A.平板划线接种环挑取10-1菌液按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后盖上也盖倒置放在40。叵温培养箱中培养48小时。B.平板涂布用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6与10-7的稀释菌悬:液各1ml对号接种于与之对应的3个无菌平板中每个平皿•放