分子标记及其在植物遗传育种中的应用.pptx

分子标记及其在植物遗传育种中的应用形态标记细胞学标记生化标记——贮藏蛋白和同工酶分子标记分子标记的分类（Staub等1996）植物遗传研究中常用的分子标记RFLP酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切5小时
电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时
染色：EtBr染色20分钟
变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼
印迹：加入0.4NNaOH，进行Southern印迹
冲洗：以2×SSC冼胶，风干—杂交—洗脱—放射自显影RFLP探针探针标记—随机引物法RFLP标记特点RAPDPolymeraseChainReaction-PCRRAPD的操作Step195℃2分钟
Step295℃15秒
Step336℃30秒
Step472℃45秒
Step5GOTOStep246循环
Step672℃5分钟主要特点DAF(DNAamplificationfingerprinting)：AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)ISSR共同优点：

在不需要知道所扩增DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹；
需DNA量少，产生多态性丰富。

缺点：
对反应条件非常敏感，重复性差。SCARs（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）微卫星标记(SSR)不同物种其重复序列及重复单位频率不同。
通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：
(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。
同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。SSR的功能两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。
不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。SSR分子标记的创制Cross-speciesSSRSSR的操作混合后，进行PCR扩增：

Step1 95℃2分钟
Step2 95℃30秒
Step3 56℃30秒
Step4 72℃60秒
Step5 GOTOStep231循环
注：SSR引物退火温度在52-65℃不等。SSR的特点：
相对的物种专一性；
由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；
实际分析时一般每次只分析单个位点；
不同引物退火温度不同，需要探索。SSR的检测银染检测程序AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)DNA

MseI-MseI MseI-EcoRI EcoRI-EcoRI

MseI-MseI片段环化，不利小片段扩增；
EcoRI-EcoRI引物的退火温度高；
MseI-EcoRI片段优先扩增
接头序列M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；
P00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';
E00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';

MseI-primers+3:5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘
EcoRI-primers+3:5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘
PstI-primers+3:5'-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘AFLP技术的特点（4）AFLP分析用样量少（0.05-0.5gDNA），而且对模板浓度的变化不敏感。
（5）由于特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。
（6）引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。
（7）银染技术具有快速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。AFLP操作具体包括三个步骤：
1.酶切--连接；
2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.5～1μg；
3.电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。
对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增—预扩增和选择性扩增。模板DNA的酶切与连接DNA片段的预扩增混合后，在如下PCR条件下扩增：
Step1 95℃2分钟
Step2 95℃30秒
Step3 56℃30秒
Step4 72℃60秒
Step5 GOTOStep231cycles
Step6 72℃5分钟AFLP的选择性扩增混合后按如下PCR程序扩增：

Step1 95℃2分钟
Step2 95℃30秒
Step3 65℃30秒（-0.7℃/cycle）
Step4 72℃60秒
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