分子标记在植物遗传育种中的应用(PPT).ppt

分子标记及其在植物(zhíwù)遗传育种中的应用形态(xíngtài)标记细胞学标记(biāojì)生化(shēnꞬhuà)标记——贮藏蛋白和同工酶分子(fēnzǐ)标记分子(fēnzǐ)标记的分类〔Staub等1996〕植物遗传(yíchuán)研究中常用的分子标记RFLP酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切5小时电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时染色：EtBr染色20分钟变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼印迹(yìnjì)：参加0.4NNaOH，进行Southern印迹(yìnjì)冲洗：以2×SSC冼胶，风干—杂交(zájiāo)—洗脱—放射(fàngshè)自显影RFLP探针(tànzhēn)探针(tànzhēn)标记—随机引物法RFLP标记(biāojì)特点RAPDPolymeraseChainReaction-PCRRAPD的操作(cāozuò)Step195℃2分钟Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循环(xúnhuán)Step672℃5分钟主要(zhǔyào)特点DAF(DNAamplificationfingerprinting)：AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)ISSR共同优点：在不需要知道所扩增DNA序列(xùliè)情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。缺点：对反响条件非常敏感，重复性差。SCARs〔SequencedCharacterizedAmplifiedRegions〕微卫星标记(biāojì)(SSR)不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索(sōusuǒ),发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差异很大。SSR的功能(gōngnéng)两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据(gēnjù)两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。SSR分子标记(biāojì)的创制Cross-speciesSSRSSR的操作(cāozuò)混合后，进行(jìnxíng)PCR扩增：Step195℃2分钟Step295℃30秒Step356℃30秒Step472℃60秒Step5GOTOStep231循环注：SSR引物退火温度在52-65℃不等。SSR的特点(tèdiǎn)：相对的物种专一性；由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程(guòchéng)，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。SSR的检测(jiǎncè)银染检测(jiǎncè)程序AFLP〔AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)DNAMseI-MseIMseI-EcoRIEcoRI-EcoRIMseI-MseI片段环化，不利(bùlì)小片段扩增；EcoRI-EcoRI引物的退火温度高；MseI-EcoRI片段优先扩增接头(jiētóu)序列M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；P00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';E00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';MseI-primers+3:5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘EcoRI-primers+3:5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘PstI-primers+3:5'-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘AFLP技术(jìshù)的特点〔4〕AFLP分析用样量少〔0.05-0.5gDNA〕，而且对模板浓度的变化不敏感。〔5〕由于(yóuyú)特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。〔6〕引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究根底的物种。〔7〕银染技术具有快速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。AFLP操作具体包括三个步骤：1.酶切--连接(liánjiē)；2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.5～1μg；3.电泳别离〔利用聚丙烯酰胺凝胶〕。对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增—预扩增和选择性扩增。