选育西罗莫司高产菌株的技术分析.docx

选育西罗莫司高产菌株的技术分析【摘要】用紫外线对吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）NP03进行诱变再采用庆大霉素抗性筛选法进行处理剂量分别为0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml共获得113株抗性突变株其中西罗莫司产量高于出发菌株的有51株突变株NP0374#的生产能力达到出发菌株的134%且遗传特性稳定。【关键词】西罗莫司；庆大霉素【中图分类号】R472【文献标识码】A【文章编号】2095-6851（2014）2-0478-02免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中有极其重要的作用。自20世纪70年代环孢素A用于临床以来器官移植的成功率大大提高但探求新的、安全有效的免疫抑制剂的工作一直在继续。西罗莫司（sirolimus）是由吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）产生的大环内酯类抗生素1977年Morris等首先发现其具有免疫抑制作用1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行使用临床应用显示它具有很好的抗排斥作用与环孢菌素A和他克莫司（FK506）等免疫抑制有良好的协同作用是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。西罗莫司除用于器官移植抗排斥药物外还可用于抗真菌、心血管支架涂料、新合成抗肿瘤抗生素CCI779的原料药预防和治疗系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病等应用前途广泛。本文报道用庆大霉素对西罗莫司产生菌进行处理以获得高产的抗性菌株。1材料与方法1.1出发菌株：吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）NP03（本实验室保存）。1.2培养基：分离培养基（%）酵母膏0.1牛肉膏0.1葡萄糖1.0琼脂1.5。斜面培养基天门冬素琼脂培养基。种子培养基（%）淀粉2.0葡萄糖0.5酵母粉0.5蛋白胨0.3；pH自然。发酵培养基（%）葡萄糖3.0黄豆饼粉3.0硫酸铵0.5淀粉1.0碳酸钙0.3；pH自然。1.3主要仪器：旋转式摇瓶机高速离心机Waters高效液相色谱仪。1.4菌种的选育方法（1）制备单孢子悬液：取NP03菌株的新鲜斜面加无菌水制成孢子悬液脱脂棉过滤收集单孢子悬液调整其浓度为106个/ml。（2）诱变处理：紫外线诱变将其孢子悬液置于15W紫外灯40cm处分别照射0、10、20和30s然后稀释分离培养。计数并统计致死率确定紫外处理时间。庆大霉素抗性突变株的筛选将用紫外诱变过的孢子悬液稀释成不同浓度分别涂布在含有0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml庆大霉素的分离培养基中28℃培养10～16d计数统计致死率；挑取不同浓度下及对照组的菌落培养后进行摇瓶初筛和复筛。1.5效价测定：高压液相外标法。2结果与分析2.1最佳照射剂量的选择：考察紫外线照射时间对菌株致死率的影响。紫外线有较强的杀菌能力和诱变能力从Tab.1可以看出NP03菌株对紫外的耐受力较弱30s的致死率几乎达到100%20s的致死率达到75.8%为保证有较高的筛选几率选择20s的UV照射剂量。2.2UV照射后庆大霉素剂量对菌株的影响：由Fig.1可知NP03菌株对庆大霉素比较敏感20s紫外照射后的菌株与庆大霉素的浓度存在着剂量效应当庆大霉素的剂量为0.01μg/ml时的致死率是90.2%0.03μg/ml的致死率是92.5%0.05μg/ml时致死率已为97.8%0.08μg/ml的致死率是99.9%。2.3用庆大霉素抗性筛选西罗莫司高产菌株：出发菌株经紫外诱变和庆大霉素处理在选择平板上随机挑选出113个菌落摇瓶初筛后有51株的发酵效价比出发菌株高有2株超过原始菌株30%以上其中突变株NP0374#高出对照菌株34%HPLC的分析图谱。2.4高产突变株遗传稳定性的考察：将突变株NP0374#传4代培养好后各代子斜面同时进行摇瓶考察相对效价的变化。Tab.2显示该菌株传代后效价无明显变化遗传稳定性较好。3讨论在微生物菌种选育中紫外线诱变处理方法简便效果好被广泛采用。抗性突变株的筛选也是获得高产菌株一种有效的的育种方法。抗性突变包括抗代谢产物、抗噬菌体、抗前体及其类似物、抗重金属离子或抗特定的有毒物质、抗培养基中的某些成分等。筛选的抗性突变株可以消除不利因素的抑制或阻遏作用达到积累目的产物的作用。由于抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁而易发生共突变所以易获得高产突变株。