一种检测植物内生菌的引物组、试剂盒和方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927750A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211116948.4(22)申请日2022.09.14(71)申请人杭州联川生物技术股份有限公司地址310018浙江省杭州市杭州经济技术开发区6号大街260号16幢四层(72)发明人吴允正梁洪殷楠楠(74)专利代理机构杭州信与义专利代理有限公司33450专利代理师万景旺(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/94(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）(54)发明名称一种检测植物内生菌的引物组、试剂盒和方法(57)摘要本发明涉及锁核苷酸扩增技术(LNA‑PCR)快速检测植物内生细菌的方法和试剂盒，该方法包括以下步骤：(1)以待检植物样品的DNA为模板，采用若干个特异引物对和至少一个通用引物对甲进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，采用至少一个通用引物对乙进行第二轮PCR扩增；(3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，纯化，上机测序，进行植物内生菌的检测；每个特异引物对为根据植物细胞器基因设计的特异性锁核苷酸(LNA)引物；各个特异引物的3’端为磷酸化修饰；通用引物对甲和/或通用引物对乙为细菌16SrDNA的通用引物。本发明提供的方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。CN115927750ACN115927750A权利要求书1/2页1.一种植物内生菌的检测方法，包括以下步骤：(1)以待检植物样品的DNA为模板，采用若干个特异引物对和至少一个通用引物对甲进行第一轮PCR扩增；(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，采用至少一个通用引物对乙进行第二轮PCR扩增；(3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，纯化，上机测序，进行植物内生菌的检测；每个特异引物对为根据植物细胞器基因设计的特异性锁核苷酸(LNA)引物；各个特异引物的3’端为磷酸化修饰；通用引物对甲和/或通用引物对乙为细菌16SrDNA的通用引物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物细胞器基因选自：Mt16S(植物的线粒体16SrDNA)、Ct16S(叶绿体16SrDNA)。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述特异性LNA引物的至少1位、2位、3位、4位或更多位碱基为锁核苷酸修饰；任选地，所述特异性LNA引物对选自：封闭线粒体引物(LNA‑Mt63/LNA‑Mt1492)、封闭叶绿体引物(LNA‑Ct63/LNA‑Ct1492)；任选地，所述通用引物对甲和通用引物对乙可以相同，也可以不同；任选地，所述通用引物对甲和/或通用引物对乙为细菌16SV3‑V4区通用引物；任选地，所述通用引物对乙包括测序接头序列和标签序列；任选地，所述通用引物对选自：63F/1494R、341F/806R。4.如权利要求1‑3任一项所述的方法，其特征在于，LNA‑Mt63的碱基序列如SEQIDNO.1所示，LNA‑Mt1492的碱基序列如SEQIDNO.2所示，LNA‑Ct63的碱基序列如SEQIDNO.3所示，LNA‑Ct1492的碱基序列如SEQIDNO.4所示，其中，碱基下方设有下划线的为锁核苷酸(LNA)修饰，3’末端p为磷酸化修饰，R＝A/G；任选地，63F的碱基序列如SEQIDNO.5所示，1494R的碱基序列如SEQIDNO.6所示，341F的碱基序列如SEQIDNO.7所示，806R的碱基序列如SEQIDNO.8所示；其中，Y＝C/T，W＝A/T，N＝A/T/C/G，H＝A/T/C，V＝G/A/C。5.如权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述特异引物对的退火温度为70℃～72℃；优选地，所述特异引物对的退火温度为70℃；任选地，所述通用引物对的退火温度为52℃～55℃；优选地，所述通用引物对的退火温度为54℃；任选地，所述第一轮PCR扩增反应步骤如下：在PCR管配制反应体系，将上述PCR管放置在PCR仪进行反应；所述反应体系包括：引物混合液，反应液，模板DNA；所述引物混合液含有上述至少一个LNA引物对和至少一个通用引物对；优选地，所述引物混合液含有封闭线粒体引物(LNA‑Mt63/LNA‑Mt1492)、封闭叶绿体引物(LNA‑Ct63/LNA‑Ct1492)和通用引物63F/1494R；任选地，所述封闭线粒体引物、封闭叶绿体引物和通用引物63F/1494R的摩尔比为(8～16)：(5～10)：(1～2)；所述进行第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃2min；94℃30s，70℃1min，54℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min；任选地，所述第二轮PCR扩增反应步骤如