单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113621689A(43)申请公布日2021.11.09(21)申请号202111011714.9C12N15/11(2006.01)(22)申请日2021.08.31(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人徐振波游姗迟骆玉婷刘君彦陈玲叶燕锐李晓玺洪玮彭芳付欣户帅锋苏健裕(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人郭炜绵(51)Int.Cl.C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/689(2018.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法(57)摘要本发明公开了单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法，该引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1‑NO.5所示。本发明针对单增李斯特菌特异性靶序列hlyA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决了现有的检测技术方法耗时长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列hlyA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统单增李斯特菌检测的周期。CN113621689ACN113621689A权利要求书1/1页1.单增李斯特菌的CPA引物，其特征在于：包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点hlyA剥离引物4s：5’‑ccgtaagtgggaaatctg‑3’(SEQIDNO.1)靶点hlyA剥离引物5a：5’‑aggcaatgggaactcctg‑3’(SEQIDNO.2)靶点hlyA交叉引物2a1s：5’‑ctcgtaagtctccgaggttccttcaaagccgtaatt‑3’(SEQIDNO.3)靶点hlyA特异引物2a：5’‑ctcgtaagtctccgaggt‑3’(SEQIDNO.4)靶点hlyA特异引物3a：5’‑cccggttaaaagtagcacc‑3’(SEQIDNO.5)。2.单增李斯特菌的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述CPA引物的浓度为10μM。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括如下组分：A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris‑HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，制成50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，制成1mM的氯化锰水溶液；(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。7.权利要求2‑6任一项所述的检测试剂盒在检测单增李斯特菌中的应用。8.单增李斯特菌的CPA检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；(2)建立检测hlyA的交叉引物恒温扩增反应体系，于59～68℃水浴中恒温反应至少60分钟，待反应完成后于75～85℃水浴中保温2分钟终止反应；(3)针对靶点hlyA的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色变为绿色，说明待检样品中含有单增李斯特菌；如颜色为黄色，说明待检样品中不含有单增李斯特菌。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，终止反应后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果呈现梯形条带说明待检样品含有单增李斯特菌，无扩增条带说明待检样品不含有单增李斯特菌。10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的模板DNA，其OD260/OD280值为1.8～2.0；步骤(2)交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液