一种毛囊干细胞的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107201341A(43)申请公布日2017.09.26(21)申请号201710566369.2(22)申请日2017.07.12(71)申请人广州润虹医药科技股份有限公司地址511356广东省广州市经济技术开发区永和经济区永盛路10号（6）栋第5层(72)发明人黄燕飞车七石刘少辉(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人张春水唐京桥(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图1页(54)发明名称一种毛囊干细胞的制备方法(57)摘要本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞的制备方法。本发明提供了一种毛囊干细胞的制备方法，为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养；步骤四、间充质干细胞诱导培养，得毛囊干细胞。通过本发明提供的技术方案制得的毛囊干细胞，毛囊干细胞的阳性标志物CK15在多数毛囊组织来源的铺路石样细胞中呈阳性表达；同时，通过流式细胞仪分析显示，在毛囊干细胞中CK15、CK19、CD200、β1表达为阳性，符合毛囊干细胞表面标记物的表达结果。本发明提供的一种毛囊干细胞的制备方法，解决了现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着：原材料获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。CN107201341ACN107201341A权利要求书1/2页1.一种毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程：表达转录调控因子导入尿液细胞后，在培养基中培养，得诱导多功能细胞；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养：所述诱导多功能细胞消化后，培养至融合度大于70％后进行诱导培养，形变得间充质干细胞；步骤四、间充质干细胞诱导培养；所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后进行诱导培养，形变得毛囊干细胞。2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述毛囊干细胞的制备方法还包括：步骤五、毛囊干细胞的扩增：毛囊干细胞于培养液E中培养；所述培养液E包括：DMEM基础培养基、FBS、0.001～0.1％T-β、1～100ng/mLhEGF、1-100ng/mLVEGF以及1～10mmol/LL-谷氨酰胺；其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。3.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一所述尿液细胞的收集方法为：尿液与青霉素/链霉素双抗混合后离心弃上清液后，再与含有青霉素/链霉素的PBS溶液混合后离心弃上清液，将剩余液体置于0.1％明胶包被的孔中，加入含PrimocinREGM培养基进行培养。4.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一所述尿液细胞的融合度大于80％。5.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤二所述表达转录调控因子选自：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4以及LIN28中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤二所述尿液细胞重编程的方法为：表达转录调控因子导入尿液细胞后，用培养液A培养一天后，更换培养基为IPS培养基mTesR培养六天后，挑选与人胚胎干细胞形态相近的单克隆，所述单克隆接种于matrigel包被的培养环境中，培养基mTesR培养得多功能细胞；所述培养液A包括：REGM与MEF。7.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤三所述多功能细胞诱导培养的方法为：所述诱导多功能细胞融合度消化后，培养至融合度大于70％后，加入培养液B培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，得间充质干细胞；所述培养液B包括：DMEM基础培养基、FBS、1～160pM胰岛素、1～10mML-谷氨酰胺、50～200ug/LbFGF、5～50ug/LSCF以及2～5×10-8mol/L地塞米松，其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；所述培养液C包括：DMEM基础培养基、FBS、1～100ng/mLhEGF、1～100ng/mLbFGF、1～50ng/mLHGF、2～20ng/mLPDGF以及1～25ng/mLTGF-β，其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。8.根据权利要求7所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，培养液B的培养时间为5～7天。9.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞消化2CN107201341A权利要求书2/2页后，培养至融合度大于80％后，加入培养液D培养，得毛囊干细胞；所述培养液D包括：DMEM基础培养基、FBS、1～115ng/mLhEGF、0.05～100ng/mLIGF、0.01～10ug/L氢化