一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105695511A(43)申请公布日2016.06.22(21)申请号201610134289.5(22)申请日2016.04.13(71)申请人中国人民解放军第三军医大学地址400038重庆市沙坪坝区高滩岩(72)发明人李玉红星懿展杨珂郭海英(74)专利代理机构重庆百润洪知识产权代理有限公司50219代理人刘立春(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法，包括如下步骤：分离培养原代小鼠毛囊干细胞；生产逆转录病毒上清液；建立永生化毛囊干细胞系：接种原代毛囊干细胞；在步骤(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；细胞贴壁后，吸掉培养基，加入含聚凝胺的病毒上清液；间隔一定时间更换新的含聚凝胺的病毒上清液；在第2轮换液时，加入潮霉素筛选；筛选3-5轮后，终止筛选，常规培养；筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。本发明所获得的永生化的小鼠毛囊干细胞在经历40次传代后，仍然能够在裸鼠上重建完整的毛囊结构。解决了毛囊干细胞无法长期培养和培养后失去干性的难题，可以大大降低毛囊干细胞研究及应用的劳动力成本及经济成本。CN105695511ACN105695511A权利要求书1/2页1.一种永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代小鼠毛囊干细胞；(2)生产逆转录病毒上清液；(3)建立永生化毛囊干细胞系：(3-1)接种原代毛囊干细胞；(3-2)在步骤(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入含聚凝胺的病毒上清液；(3-4)间隔一定时间更换新的含聚凝胺的病毒上清液；(3-5)在第2轮换液时，加入潮霉素筛选；(3-6)筛选3-5轮后，终止筛选，常规培养；(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。2.如权利要求1所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)中具体步骤如下：(3-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种原代毛囊干细胞，起始密度为30-60％融合；(3-2)在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使终浓度为5-20ug/ml；(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；(3-4)每8-12小时换新的含聚凝胺的病毒上清液；(3-5)在第2轮换液时，加入终浓度为100-400ug/ml的潮霉素筛选；(3-6)筛选4-5轮后，终止筛选，改用正常的毛囊干细胞培养基常规培养；(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。3.如权利要求1或2所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：(2-1)接种HEK293细胞；(2-2)准备转染试剂；(2-3)充分混合转染试剂后室温放置；(2-4)洗HEK293细胞，加入无血清的DMEM培养基；(2-5)加入上述混合后的转染试剂；(2-6)吸掉培养基，加含血清的培养基；(2-7)在转染后间隔一定时间分别收集病毒上清液，暂存。4.如权利要求3所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体采用如下步骤：(2-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，起始密度为30-60％融合；(2-2)接种6-8小时后，准备转染试剂：500ulDMEM培养基，10ulpAmpho质粒，5-10ul含SV40T抗原的逆转录病毒载体质粒，10-20ul脂质体；(2-3)充分混合转染试剂后，室温放置20分钟；(2-4)用无血清的DMEM培养基洗HEK293细胞3遍，加入2ml无血清的DMEM培养基；(2-5)加入上述混合后的转染试剂；(2-6)3-5小时后，吸掉培养基，加3ml含血清的培养基；(2-7)在转染后的24小时，48小时，72小时，96小时分别收集病毒上清液，暂存于4度冰2CN105695511A权利要求书2/2页箱。5.如权利要求1-4中任一项所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤(4)：鉴定永生化毛囊干细胞系。6.如权利要求5所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4)中包括如下步骤：(4-1)细胞传代能力鉴定；(4-2)形态学鉴定；(4-3)标记物鉴定；(4-4)生物学鉴定。7.如权利要求6所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4-1)中，按常规培养方法对永生化的毛囊干细胞进行反复传代，在细胞传代至第40代时，仍具有良好的生长能力，取传至第40代的永生化的毛囊干细胞进行进一步鉴定。8.如权利要求6或7所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4-2)中，