一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107603974A(43)申请公布日2018.01.19(21)申请号201711087089.X(22)申请日2017.11.07(71)申请人泰州达安达瑞医学检验有限公司地址225300江苏省泰州市泰州中国医药城口泰路东侧、园南路南侧三期厂房A2栋一层(72)发明人李明陆颖锶杨俊黄曦韩丽娜何金津周进生丘远辉(74)专利代理机构南京正联知识产权代理有限公司32243代理人卢霞(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法(57)摘要本发明提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒，包括1）前处理剂；2）DNA提取液Ⅱ；3）DNA提取液D；4）DNA溶解液；5）无水乙醇和75%乙醇。本发明还提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒。本发明具有如下技术效果：本发明有较高的重复稳定性，不需要重复试验，在50例志愿者尿液DNA提取中，仅一次提取即得高质量的模板DNA，在对全外显子的扩增中，所有提取的尿液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明的可靠性。CN107603974ACN107603974A权利要求书1/1页1.人类尿液DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括：1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；所述的前处理剂为PEG6000；所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L，EDTA20mmol/L，二硫苏糖醇32.5mmol/L，Tris-HCl10mmol/L，TritonX-1004％v/v；所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L；所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL10mM。2.使用如权利要求1所述的试剂盒用于人类尿液DNA的提取方法，其特征在于，包括前处理和DNA提取，具体步骤如下：A、前处理：1)取尿液分装至离心管中，加入PEG6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解；2)离心，去上清，剩2ml液体；3)充分重悬剩余液体并将其转移至离心管中，往其中加入PBS缓冲液，离心；4)离心结束后，弃去上清留1ml液体，往其中加入PBS缓冲液混匀，再转移至离心管中，离心；5)弃去上清，留200μL保留在离心管中，-20℃保存；B、DNA提取：1)根据尿液前处理后的体积，在样本中加入等体积的DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解；2)孵育后加入DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液；3)向细胞裂解液加入无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置后，离心，倒弃滤液；4)往离心柱中加入75％乙醇，离心；5)重复第4步一次；6)将离心柱再离心以去除残留液体；7)取出离心柱放至另一洁净的离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min挥发残留乙醇后，在柱中央加入56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min；8)将离心管和收集管一起放进离心机离心，离心，收集DNA溶液于上述离心管中，丢弃离心柱；DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。2CN107603974A说明书1/6页一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法。背景技术[0002]膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，约95％来源于膀胱上皮。其中膀胱尿路上皮癌是泌尿道的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润膀胱癌(non-muscleinvasivebladdercancer,NMIBC)，而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscleinvasivebladdercancer,MIBC)。目前用于膀胱癌预防复发的药物疗效并不理想。高达40％-80％的患者会发生一次或多次复发，10％-15％的患者会发展为更高级别的肿瘤或发生转移。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。[0003]传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，