一种构建DNA大片段文库的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107794573A(43)申请公布日2018.03.13(21)申请号201611046464.1(22)申请日2016.11.23(66)本国优先权数据201610791466.72016.08.31CN(71)申请人安诺优达基因科技（北京）有限公司地址100176北京市北京经济技术开发区科创六街88号院8号楼2单元701室申请人浙江安诺优达生物科技有限公司安诺优达（义乌）医学检验有限公司(72)发明人梁峻彬李小林张介中韩典昂刘三阳玄兆伶李大为陈重建(51)Int.Cl.C40B50/06(2006.01)C40B40/06(2006.01)C12Q1/68(2018.01)权利要求书2页说明书14页序列表2页附图2页(54)发明名称一种构建DNA大片段文库的方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种DNA大片段文库的构建方法及其应用。本发明提供的DNA大片段文库的构建方法用于DNA大片段文库的构建，包括将DNA大片段的两端加上具有脱氧尿苷的接头，通过酶的消化得到具有黏性末端的大片段DNA；以及将具有黏性末端的大片段DNA进行环化，得到环化大片段DNA的步骤。通过本发明的文库构建方法可以提高大片段文库的有效数据率。此外本发明通过对接头进行特殊设计，还可以为构建的大片段DNA文库提供质控点。CN107794573ACN107794573A权利要求书1/2页1.一种DNA大片段文库的构建方法，包括：步骤B：将经过处理的DNA大片段的两端加具有脱氧尿苷的接头，得到具有脱氧尿苷的DNA大片段，所述接头带有生物素标记；步骤C-1：采用具有脱氧尿苷切割功能的酶切割具有脱氧尿苷的DNA大片段，得到带有缺口的DNA大片段；步骤C-2：采用高温条件处理带有缺口的DNA大片段，使缺口至3'端的碱基序列游离，得到具有黏性末端的DNA大片段；步骤D：将具有黏性末端的DNA大片段进行环化，得到环化DNA大片段。2.根据权利要求1所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，所述环化DNA大片段中除去所述DNA大片段以外的碱基序列为连接区域，所述连接区域包括至少一个切割位点，优选地，所述切割位点为酶切位点。3.根据权利要求1或2所述的DNA大片段文库的构建方法，还包括在所述步骤D之后进行的步骤E，将所述环化DNA大片段进行线性消化，得到消化后的环化DNA大片段；步骤F：将所述消化后的环化DNA大片段进行打断，得到测序用DNA片段；步骤G：将测序用DNA片段进行片段捕获，采用链霉亲和素化固相载体钓取带有生物素标记的测序用DNA片段；步骤H：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库，优选地，所述步骤G为步骤H-步骤J，步骤H：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；步骤I：将步骤G中得到的平末端DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；和步骤J：将加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。4.根据权利要求3所述的DNA大片段文库的构建方法，还包括在步骤B之前进行的步骤A：将固定长度DNA大片段进行末端修复，或者进行末端修复和加A碱基，得到经过处理的DNA大片段；和/或在步骤A之前进行的步骤A-0：将希望进行测序的DNA片段打断，得到DNA大片段，优选地，DNA大片段的片段大小为1.5k～30kbp，优选2k～10kbp，更优选3k～5kbp。5.一种DNA大片段文库的质量检测方法，将通过权利要求1-4任一项所述的DNA大片段文库的构建方法得到的测序用DNA片段或扩增产物作为待测样本，所述待测样本包括切割位点，并进行如下步骤：步骤K：将待测样本进行琼脂糖凝胶电泳，得到待测样本电泳条带；步骤L：将待测样本进行切割处理，得到质检样本；步骤M：将质检样本进行琼脂糖凝胶电泳，得到质检样本电泳条带；步骤N：质检样本电泳条带的位置均值与待测样本电泳条带的位置均值，当质检样本电泳条带的位置均值移至待测样本电泳条带的位置均值的一半±10％处时，判断待测样本为合格文库。6.一种DNA大片段文库，其是通过权利要求1-5中任一项所述的DNA大片段文库的构建2CN107794573A权利要求书2/2页方法构建得到的。7.一种DNA大片段文库的测序方法，以权利要求9所述的DNA大片段文库作为对象进行测序，优选地，所述测序为双端测序。8.一种用于构建DNA大片段文库的试剂盒，用于实施权利要求7所述的DNA大片段文库的构建方法，包括加接头试剂，所述加接头试剂包括具有脱氧尿苷的接头，切割试剂，所述切割试剂包括具有脱氧尿苷切割功能的酶。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述具有脱氧尿苷的接头在一条链上有一