一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108486002A(43)申请公布日2018.09.04(21)申请号201810208854.7A61K31/715(2006.01)(22)申请日2018.03.14A61P3/10(2006.01)A61P39/06(2006.01)(83)生物保藏信息C08B37/00(2006.01)CGMCCNo.152272018.01.16C12R1/07(2006.01)(71)申请人广西师范大学地址541004广西壮族自治区桂林市七星区育才路15号(72)发明人赵丰丽张昌志范彩琴龙楚媚付强陈静(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司11212代理人杨立周玉婷(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)权利要求书2页说明书21页C12P19/04(2006.01)序列表2页附图5页(54)发明名称一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用(57)摘要本发明公开了一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用，属于微生物技术领域。该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillussp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15227，保藏日期为2018年1月16日。本发明还公开了利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法和应用。本发明的罗汉果内生菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖在体外既有降糖作用又有抗氧化作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株。CN108486002ACN108486002A权利要求书1/2页1.一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株，其特征在于，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillussp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15227，保藏日期为2018年1月16日。2.一种权利要求1所述的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株在生产胞外多糖中的应用。3.一种利用权利要求1所述的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将权利要求1所述的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillussp.ND-6划线接种于新鲜的斜面培养基上，于37℃培养24h，得到活化的斜面菌种；步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取5环接种于装有70mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；然后按照5％(v/v)-8％(v/v)的接种量，将种子液接种于装有600mL液体发酵培养基的1000mL锥形瓶中，35℃、160r/min摇床培养72h，得到发酵液；步骤3：将步骤2得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行减压浓缩，纯化,再透析，对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。4.根据权利要求3所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤1中，所述斜面培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO30.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。5.根据权利要求3所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤1中，步骤2中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO30.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后，即得种子培养基或液体发酵培养基，pH值自然。6.根据权利要求3所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤3中，所述纯化的方法为：在减压浓缩后的溶液中，加入95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到60％(v/v)以上，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第一次沉淀和第一次上清液；在第一次上清液再加95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到70％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第二次沉淀和第二次上清液；合并第一次沉淀和第二次沉淀，再按质量体积比(g/mL)1:25的比例，加蒸馏水溶解后过滤，滤液加95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得沉淀物粗多糖；将沉淀物粗多糖用蒸馏水溶解为质量百分数为5％-10％的溶液后，加三氯乙酸溶液，震荡混合均匀，使溶液中三氯乙酸的含量达到15％(v/v)，5-10℃静置12h，4000r/min离心15min，得蛋白质沉淀和上清液；上清液再加入95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得到胞