毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶_鲎素融合蛋白发酵条件的优化.pdf

动物医学进展,2011,32(8):3236
ProgressinVeterinaryMedicine

毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶鲎素融合

*
蛋白发酵条件的优化
高宇,赵红蕾,冯新,刁昱文,刘珊珊,李林溪,顾敬敏,韩文瑜,雷连成*
(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062)

摘要:能分泌表达重组人溶菌酶鲎素融合蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌(X33/
pPICZAhumanlysozymeTachyplesin构建的)。除了基因本身内在特性外,表达条件对外源基因的表
达量也有着极显著的影响。本文在摇瓶水平上通过发酵液起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间这3个因素进
行表达条件优化。通过生长曲线,Bradford检测以及平板扩散试验分析,获得摇瓶发酵表达人溶菌酶鲎素
融合蛋白的最佳条件为发酵液初始pH5.0,甲醇诱导浓度为2.0%,诱导时间为72h;Bradford检测法分析
显示表达量最高,平板扩散试验显示融合蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)抑菌能力最明显,为进一步
大规模发酵表达人溶菌酶鲎素融合蛋白奠定了基础。
关键词:毕赤酵母;人溶菌酶鲎素融合蛋白;表达条件;优化

中图分类号:Q93;Q789文献标识码:A文章编号:10075038(2011)08003205

抗生素的滥用不仅导致了动物性食品药物残菌酶的生产提供了一条可选择的途径。
留等公共卫生隐患,而且由于耐药性菌株的出现,
[1]
使细菌性疾病的防治比较困难。Humanlyso巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)作为一种高
zyme(HLYZ)是一种具有显著效果的抗微生物肽,效的外源基因表达系统已经被成功应用于多种外源
能够特异性的裂解N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁蛋白的表达[6]。作为一种较为成熟的表达系统,具
酸之间的1,4糖苷键,催化水解细胞壁的肽聚有原核生物生长快、易工业化的特点,而且能够生
[2]
糖。人溶菌酶独特的作用机制使其能同时有效地长在以甲醇作为单一碳源和能源的培养基上,具有
[3]
杀伤革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。由于HLYZ和其他真核表达系统一样的优点,如蛋白质加工、折
作用机制不同于化学抗菌药物,因而溶菌酶对耐药叠、翻译后修饰等[7,8]。本研究室已成功构建了表达
菌同样具有很好的抑杀作用。与人溶菌酶同属且结人溶菌酶鲎素融合蛋白的毕赤酵母X33工程菌株,
构相似的鸡蛋清溶菌酶已经作为洗眼剂和抗炎药物
然而影响外源基因表达的因素很多,因此,为了使外
而成功应用于临床。人溶菌酶比鸡蛋清溶菌
HLYZ源基因在毕赤酵母中获得尽可能高的表达,非常有
酶具有更高的安全性和更低的免疫原性所以人溶
,必要进行表达条件的优化。我们分别在不同诱导时
菌酶的大规模生产及其临床应用是究热点之一[4]。
间、不同的pH和不同的甲醇诱导浓度等方面进行
鲎素(Tachyplesin)是从马蹄蟹血细胞中分离的
了初步对比研究,得到了一套较完善的在巴斯德毕
一种具有17个氨基酸的小分子多肽,是马蹄蟹的内
赤酵母人溶菌素鲎素中表达基因的优化条件,为今
源性防御因子之一。鲎素和细菌脂多糖具有很高的
后在发酵罐中大规模生产提供参考。
亲和力,在低浓度下通过脂多糖介导就能抑制革兰
阳性和阴性细菌生长[5]。目前应用的人溶菌酶大部1材料与方法
分是从人乳和胎盘中提取的,由于受到来源和规模1.1材料
的限制,存在着人溶菌酶产量不高、质量不稳定且生1.1.1菌株巴斯德毕赤酵母表达菌株X33/
产成本昂贵等问题。利用基因工程手段生产人溶菌pPICZAHLYZTachyplesin由吉林大学兽医微
酶不仅对上述问题的解决具有积极作用,也为人溶生物与免疫实验室构建并保存;金黄色葡萄球菌标

*收稿日期:20110517
基金项目:吉林省科技平台计划项目(20070210)
作者简介:高宇(1986-),男,四川雅安人,硕士研究生,主要从事兽医微生物和免疫学研究。*通讯作者
高宇等:毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶鲎素融合蛋白发酵条件的优化33

准菌株(ATCC25923)由吉林大学兽医微生物与免离心10min。由于真核表达载体pPICZA为分泌
疫实验室保存。型表达载体,所以外源蛋白由信号肽牵引,蛋白酶切
1.1.2主要试剂酵母提取物(Yeast),蛋白胨割后分泌到发酵液上清中,因此离心所取的上清液
(Peptone)和葡萄糖(Dglucose)购自Oxide公司;酵即为粗蛋白液。
母氮源(YNB)为Invitrogen公司产品;基础培养基1.2.4蛋白表达量检测蛋白表达量测定方法:
YPD(Yeast,PeptoneandDgl